Ce protocole décrit une méthode simple et reproductible pour purifier et culturer des types spécifiques de neurones primaires. Ces cultures conviennent à l’analyse électrophysiologique, morphologique et de survie. Les cultures de neurones purifiés peuvent être utilisées pour étudier les principes fondamentaux de la physiologie neuronale, la formation de synapses ainsi que la façon dont les réseaux neuronaux se développent.
Tandis que nous nous concentrons sur les cellules principales glutamatergic corticales et les interneurones GABAergic, cette procédure peut être facilement modifiée pour étudier n’importe quelle lignée neuronale exprimant des protéines fluorescentes. Pour préparer des couvertures en verre, décongelez d’abord un aliquot de cinq millilitres de 200 microgrammes par solution millilitre de PLL. Diluer cette solution de stock à 20 microgrammes par millilitre en ajoutant 45 millilitres d’eau pure de qualité injection.
Filtrez ensuite stérilisez la solution dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et étiquetez ce tube comme stérile PLL. Ensuite, placez 100 couvertures de verre stériles rondes de 12 millimètres dans la solution stérile PLL. Agiter le tube toutes les cinq à dix minutes pendant deux à trois minutes pour assurer un revêtement même.
Après 40 minutes de revêtement PLL, prendre deux morceaux de papier de soie et les déposer à plat dans l’armoire d’écoulement. Stériliser le papier à l’aide de 70% d’éthanol puis aplatir pour enlever les plis et laisser sécher. Après avoir enduit les couvercles en verre pendant une heure avec PLL, retirer l’excès de solution PLL et ajouter de l’eau stérile de qualité injection.
Agiter doucement les coverslips pendant deux à trois secondes pour enlever l’excès de PLL. Répétez cette étape de rinçage deux fois de plus. Retirer l’excès d’eau, puis transférer les coverslips sur le papier de soie stérile.
Une fois secs, transférer les coverslips dans une plaque de culture de 24 puits. Pour préparer les solutions de culture cellulaire, mesurez 12 millilitres de tampon de culture cellulaire à un tube conique de 15 millilitres et étiquetez-les sous le nom de BSA. Mesurez cinq millilitres de tampon de culture cellulaire à un tube différent de 15 millilitres et étiquetez comme papain.
Par la suite, incuber les deux tubes pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Ajouter 120 milligrammes de BSA au tube étiqueté BSA. Puis inverser le tube pour aider à dissoudre la solution.
Ajouter ensuite sept milligrammes de papaïne au tube étiqueté papain. Remettre les deux tubes au bain d’eau pendant 15 minutes. Filtre stériliser la solution BSA dans un tube conique frais.
Divisez la solution stérile BSA en trois tubes et étiquetez chaque tube comme stérile BSA et un, deux ou trois. Filtrez maintenant stérilisez le tube de papain et étiquetez le tube comme papain stérile. Remettre tous les tubes au bain d’eau et continuer à couver à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient utilisés.
Pour se préparer à la dissection tissulaire, mentez le scalpel, les ciseaux, les forceps et la spatule nécessaires à la dissection de l’hippocampe et du cortex. Placer deux boîtes de Pétri de 35 millimètres et une boîte petri de 100 millimètres contenant du papier filtre stérile dans l’armoire à écoulement. Recueillir le NexCre transgénique; Ai9 ou véhicule GABA transporteur Venus chiots souris qui doivent être disséqués à l’aide d’une lampe fluorescente avec excitation appropriée et filtres d’émission pour discriminer les chiots fluorescents de type sauvage compagnons litre.
Immédiatement avant de disséquer les animaux, remplissez chaque boîte de Pétri d’un tampon de culture cellulaire stérile réfrigéré. Après la dissection, transférer soigneusement le cerveau du chiot transgénique dans un papier filtre stérile. Tout d’abord, disséquer le cervelet et séparer les deux hémisphères.
Séparez ensuite soigneusement l’hippocampe et le cortex de chaque hémisphère. Transférer le tissu disséqué dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant un tampon de culture cellulaire réfrigérée. Ensuite, transférez l’hippocampe disséqué et le cortex au couvercle d’une autre boîte de Pétri de 35 millimètres.
À l’aide du bord plat d’une lame de scalpel, hacher délicatement le tissu en mouvement sillonné jusqu’à ce qu’il ne reste que de petits morceaux. Ensuite, transférez le tissu haché avec une petite quantité de solution de papain du couvercle de la boîte de Petri au tube stérile de papain. Incuber le tissu à 37 degrés Celsius pendant 25 minutes.
Après l’incubation de la papaine, transférer le tube stérile de papain et les tubes stériles de BSA à l’armoire d’écoulement. Ensuite, utilisez une pipette Pasteur d’un millilitre pour transférer uniquement le tissu corticohippocampal du tube de papain dans le tube BSA. Afin de briser toutes les grandes touffes de tissu, triturer le tissu à plusieurs reprises à l’aide d’une pipette Pasteur d’un millilitre.
Par la suite, triturer le tissu sept fois à l’aide d’une pipette pasteur fine pointe. Après 30 secondes, transférer un millilitre de la solution inférieure et du tissu du tube BSA un au tube BSA deux. Triturer le tissu dans le tube BSA deux fois à l’aide d’une pipette pasteur fine pointe.
Après trituration, transférer un millilitre du tissu inférieur et la solution du tube BSA un au tube BSA trois. Triturer le tissu dans le tube BSA trois fois. Après trituration, transférer toute la solution et le tissu des tubes deux et trois dans le tube BSA un.
Triturer deux à trois fois de plus et centrifugeuse à 3000 fois g pendant trois minutes. Après centrifugation, retirez soigneusement le supernatant du tissu granulé et resuspendez les cellules à l’aide d’une pipette P1000 en deux millilitres d’hibernation complète Un milieu de faible fluorescence. Puis triturer le tissu 20 fois pour assurer une résuspension complète de la solution tissulaire.
Par la suite, déposez la suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire de 30 micromètres dans un tube d’échantillon de polystyrène. Préparer les tubes de collecte de tri cellulaire en pipetant 300 microlitres de supports complets en hibernation A au nombre requis de tubes en polypropylène. Pour que chaque type de cellule fluorescente soit trié, choisissez les filtres d’excitation et d’émission appropriés.
Excitez la protéine Venus à l’aide de la longueur d’onde d’excitation de 488 nanomètres et détectez la lumière émise à l’aide d’un ensemble de filtres à émissions de 530/40. Excitez la protéine TdTomato à l’aide d’une longueur d’onde d’excitation de 531 nanomètres et détectez la lumière émise à l’aide d’un ensemble de filtres à émission 575/30. Pour une grande pureté, trier les cellules fluorescentes brillamment étiquetées.
Après le tri cellulaire, transférer les cellules collectées dans deux tubes de centrifugeuse arrondis au fond millilitres. Puis centrifuger les cellules à 3000 fois g pendant trois minutes pour former une pastille cellulaire. Resuspendez la pastille cellulaire dans la quantité requise de milieu NBA complet préchauffé pour atteindre une densité cellulaire de 1000 cellules par microlitre.
Pour confirmer la présence de cellules dissociées, vérifiez la solution cellulaire au microscope à l’aide d’un 4X ou d’une lentille objective 10X. Avant de placage des cellules, vortex à une vitesse moyenne pendant deux à trois secondes pour assurer une suspension cellulaire même. Après vortex, pipette rapidement 10 microlitres de la suspension cellulaire au centre de chaque coverslip.
Après une heure, nourrir les cellules avec 500 microlitres de milieu NBA complet préchauffé et retourner à l’incubateur à 37 degrés Celsius. Pour co-culturener les neurones purifiés et les cellules gliales, passer les cellules gliales au nombre requis d’inserts de culture cellulaire. Cela se fait en placage de 40 000 cellules gliales dans une gouttelette de 500 microlitres de milieu NBA complet.
Après une heure, transférer des inserts de culture cellulaire glianaire vers des neurones purifiés. Retirez l’excès de médias des inserts de culture et retournez les plaques à l’incubateur pour la culture. Après un tri réussi, les neurones plaqués doivent apparaître de forme ronde avec une membrane lisse et devraient être vus pour épargner les neuroïdes après environ une heure in vitro.
Par sept jours in vitro, bien qu’une certaine mort cellulaire puisse être apparente, les cellules viables devraient être présentes dans toutes les conditions de culture. L’analyse des cultures purifiées révèle que les neurones glutamatergiques et gabaergiques ont pu étendre les axones et les dendrites de leur corps cellulaire et conserver la capacité de générer des potentiels d’action en réponse aux injections actuelles super seuil dépolarisant. Notamment après purification, seuls les neurones GABAergic ont reçu une quantité significative de transmission synaptique spontanée et les neurones glutamatergiques ont reçu très peu de transmission synaptique en l’absence de cellules gliales.
Fait important, la culture de neurones purifiés avec des cellules gliales améliore la croissance et la survie des neurones ainsi que la promotion de la transmission synaptique dans les cultures glutamatergiques. Un revêtement polarisant suffisant des couvre-couvertures et le maintien du pH physiologique des médias culturels tout au long de la procédure sont essentiels pour assurer des cultures cellulaires de bonne qualité. Suivant ce protocole, il devrait être possible d’effectuer le séquençage de l’ARN et la spectroscopie de masse protéique sur les cultures purifiées permettant d’étudier les processus translationnels et transcriptionnels dans des types neuronaux spécifiques.
