Les auteurs tiennent à remercier l&#39;assistance de Mme Sue Connell pour son expertise dans l&#39;intégration de la résine et Mme Stephania Tombeaux pour son expertise en laboratoire. Les auteurs tiennent à remercier le professeur Frank Kandziora et le Dr Marie-Anne Polboth pour leurs conseils.

<ol><li> Le tissu est placé dans un récipient scellé contenant du phosphate tamponnée à 10% une solution de formol 3. Assurer une exposition minimale à la lumière, si l&#39;analyse fluorochrome doit être exécuté, comme les fluorochromes sont sensibles à la lumière. </li><li> Établir dont l&#39;orientation du tissu sera nécessaire. </li><li> Coupez le spécimen à la taille, l&#39;orientation correcte, en utilisant une scie à ruban. Mesures de sécurité Assurez-vous sont respectées. L&#39;échantillon est ensuite placé dans un récipient opaque, dont le volume devrait être d&#39;environ dix fois la taille de l&#39;échantillon pour obtenir une fixation adéquate. Le spécimen doit rester dans la solution de formol au total entre un et deux semaines en fonction de sa taille. Il est suggéré d&#39;utiliser des tissus de contrôle fins de test et d&#39;optimisation. </li><li> Vérifiez le tissu s&#39;inscrit dans le moule enrobage et placer le tissu dans un récipient opaque scellée contenant 70% d&#39;éthanol. </li><li> Traiter les tissus dans l&#39;ordre croissant des concentrations de l&#39;éthanol, le blindage de la lumière et sous agitation constante. <ol class="lalpha"><li> 70% d&#39;éthanol 1 semaine </li><li> 80% d&#39;éthanol 1 semaine </li><li> 90% d&#39;éthanol 1 semaine </li><li> 100% d&#39;éthanol 1 semaine </li></ol></li><li> Le tissu est ensuite effacé au butanol pour 1 semaine, nouveau blindage de la lumière et sous agitation constante. </li><li> La densité de la résine et l&#39;os devrait être étroitement appariés. La densité de la résine peut être modifiée (voir étape 8) et nous recommandons l&#39;intégration d&#39;un premier spécimen d&#39;analyse afin d&#39;assurer la densité correcte. Nous utilisons Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) pour la microscopie optique et analyse fluorochrome. Si l&#39;immunohistochimie est nécessaire d&#39;une résine de rechange doivent être utilisés tels que Technovit 9100 (Heraeus Kulzer). </li><li> La solution la préparation Technovit 7100 peut être mélangé avec de petites aliquotes de la solution adoucissante fourni avec le kit, si nécessaire, mais pas plus de 5% du volume de solution de préparation, dans notre expérience, la solution adoucissante est rarement nécessaire. À parts égales de l&#39;éthanol absolu et Technovit liquide de base 7100 sont mélangés et appliqués au tissu comme une solution de pré-imprégnation pendant 24 heures en minimisant l&#39;exposition lumineuse et avec agitation. </li><li> La solution d&#39;infiltration est alors faite en utilisant une durcisseur g I (= 1 sac) qui est dissout dans 100 ml de liquide de base. Cela remplace la solution de pré-imprégnation et est autorisé à infiltrer pour 1 semaine sous agitation constante. </li><li> Placez le tissu dans le moule, avec le visage surface de coupe vers le bas. S&#39;assurer qu&#39;il ya une marge (idéalement au moins 5 millimètres) autour du tissu pour la résine, ce qui assure la force du bloc. Mélanger 15mls de solution Technovit préparation 7100 avec 1 ml de durcisseur II et verser autour spécimen dans le moule et couvrir au moins 5 millimietres. Durcissement débutera dans les 2 heures, mais sera complet durant la nuit. </li><li> Le montage est ensuite effectué en façonnant un bloc en utilisant la sauvegarde Technovit 3040 (Heraeus Kulzer). Mélanger Technovit 3040 dans un rapport volumique de 2 parties de poudre pour 1 partie liquide pour obtenir un liquide visqueux. Verser Technovit 3040 dans le renfoncement à l&#39;arrière du bloc à un niveau d&#39;au moins 2 mm au-dessus de la base du bloc. Après environ 10 minutes, le moule peut être décollée et le bloc est prêt. </li><li> La densité et donc les propriétés de coupe de résine méthacrylate sont sensibles à l&#39;humidité ambiante dans la pièce. Les blocs doivent donc être stockés dans un dessiccateur. </li><li> Sectionnement sol produit des sections plus grandes entre 20-50 micromètres d&#39;épaisseur. Il est utile pour l&#39;analyse de fluorochrome (voir la section ci-dessous) en tant que sections plus épaisses de produire plus lumineux de fluorescence. Fixez la lame de diamant pour macrotome. Ajouter lubrifiant, tel que l&#39;essence de pétrole au réservoir sur le macrotome. Fixez le bloc de la pince et d&#39;orienter à la lame. Autoriser broyage pour produire lentement (environ 20-30 minutes par section) assurer une lubrification adéquate. La première section expose la face de coupe et oriente la section-elle doit être jetée. </li><li> La section suivante est alors placé sur une lame Superfrost Plus. La section a tendance à s&#39;enrouler afin que nous vous recommandons de placer une partie d&#39;un sac à sandwich sur elle puis le tenant à plat avec une autre lame serré en place. Il est ensuite placé dans un incubateur de 60-80 degrés Celsius pendant 1 heure. Cela adoucit le méthacrylate et contribue à la section adhérer à la lame de façon à plat. </li><li> La section du sol peut être nettoyé et poli comme l&#39;exige l&#39;aide de papier de verre fin en douceur. </li><li> Le microtome luge coupes fines sections, qui fournit les meilleures sections pour microsocopy lumière. Utiliser un microtome luge comme il l&#39;a ajouté la rigidité, ce qui est requis pour la coupe de ces blocs durs. Alternativement un microtome alimenté rotatif peut être utilisé. Utilisez une lame en acier inoxydable de forte. Il est préférable d&#39;avoir deux lames disponible en tant que l&#39;on peut être aiguisée que l&#39;autre est utilisé. La lame doit faire un angle de 45 degrés avec le bloc. Suadoucissant rface peut être réalisé en appliquant un papier humide sur le bloc si nécessaire. Cela peut prendre plusieurs sections à réaliser les conditions de coupe désirée pour obtenir une section de qualité. La section est alors flotté sur un bain d&#39;eau et placé sur une lame comme dans 16 ci-dessus. </li><li> Réactifs de coloration sont énumérés dans des matériaux ci-dessous. Les protocoles sont basés sur 4 Bancroft et al. En raison de la variation d&#39;épaisseur, il est recommandé d&#39;optimiser les taches sur les lames de test. Coloration rack peut causer des tissus de flotter hors de la diapositive pour ajouter des taches directement à une diapositive plat peut être nécessaire. Un protocole identique ou coloration rack est nécessaire pour des résultats cohérents coloration requis pour histomorphométrie. <ol class="lalpha"><li> Hématoxyline-éosine <ol class="lroman"><li> Colorer à Haematoxyilin 5-10 minutes </li><li> Laver abondamment à l&#39;eau du robinet Scott s </li><li> Tache à l&#39;éosine 5 minutes </li><li> Laver à l&#39;eau du robinet </li><li> Clarifier dans le xylène </li><li> Mont </li><li> Résultats <ol><li> Ostéoïde = rose </li><li> Os calcifié = brun violacé </li><li> Noyaux = bleu </li></ol></li></ol></li><li> Von Kossa <ol class="lroman"><li> Placez dans une solution de nitrate d&#39;argent et d&#39;exposer à une forte lumière jusqu&#39;au os minéralisé devient noir (environ 10 mn) </li><li> Laver à l&#39;eau distillée trois fois </li><li> Menace au thiosulfate de sodium pendant 5 minutes </li><li> Laver à l&#39;eau distillée </li><li> Contre Safrinin avec O </li><li> Clarifier dans le xylène </li><li> Mont </li><li> Résultats <ol><li> Osseuse minéralisée = noir </li><li> Ostéoïde = rouge / rose </li></ol></li></ol></li><li> Masson Goldner s Trichrome <ol class="lroman"><li> Laver à l&#39;alcool alcalin (90mls d&#39;éthanol à 80% et d&#39;ammoniac 10mls 25% pendant 20 minutes) </li><li> Rincer à l&#39;eau </li><li> Rincer à l&#39;eau distillée </li><li> Colorer à l&#39;hématoxyline de Weigert s pendant 10 minutes </li><li> Rincer à l&#39;eau distillée </li><li> Colorer à Ponceau-fuchsine solution finale 5 minutes </li><li> Rincer avec de l&#39;acide acétique à 1% 15 secondes </li><li> Colorer dans acide phosphomolybdique-Solution orange G 5 minutes </li><li> Rincer avec de l&#39;acide acétique à 1% 15 secondes </li><li> Tache de lumière verte 5 minutes </li><li> Rincer avec de l&#39;acide acétique à 1% 3 changements </li><li> Rincer à l&#39;eau distillée </li><li> Mont </li><li> Résultats <ol><li> Osseuse minéralisée = vert </li><li> Ostéoïde = rouge / orange </li><li> Les noyaux gris bleu = </li><li> Cartilage = violet </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Les préparations fluorochrome: </li><li> Ce sont administrés par injection intraveineuse lente, au moins deux semaines d&#39;intervalle. </li><li> Doses <ol class="lalpha"><li> Calcéine vert 10 mg / kg IV </li><li> Oxytétracycline 50 mg / kg IV </li><li> Alizarine complexone 30 mg / kg IV </li></ol></li><li> Préparation de calcéine verte <ol class="lalpha"><li> Un gramme de calcéine vert est titré avec NaOH 1 M jusqu&#39;à dissolution. </li><li> pH est ajusté avec NaOH à 1% jusqu&#39;à pH = 7.1 au 7.2. </li><li> Filtre et de garder à l&#39;abri de la lumière </li></ol></li><li> Préparation de Alizarine complexone <ol class="lalpha"><li> Trois grammes de Alizarine complexone est titré avec NaOH 1 M jusqu&#39;à dissolution. </li><li> pH est ensuite ajusté à 1% HCl ou NaOH jusqu&#39;à pH = 7.1 à 7.2. </li><li> Filtre et de garder à l&#39;abri de la lumière </li></ol></li><li> Préparation de l&#39;oxytétracycline <ol class="lalpha"><li> L&#39;oxytétracycline est disponible comme sur l&#39;étagère de médicaments anti-microbiens. Aucune préparation n&#39;est nécessaire. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Atlas of Functional Histology. , 164-168 (2000).</li><li>Parfitt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+histomorphometry:+standardization+of+nomenclature,+symbols,+and+units.+Report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee.">Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).</li><li>An, Y. H., Martin, K. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of histology methods for bone and cartilage. , (2003).</li><li>Bancroft, J. D., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and Practice of Histological Techniques. , 352-360 (2008).</li></ol>

Solvants: <ul><li> 10% d&#39;acide normal tamponné formol, l&#39;éthanol, xylène et le butanol Tous grade histologique, sans soufre. GRALE scientifique Pty Ltd http://www.grale.com.au </li></ul> Moules: <ul><li> Peler, des moules en plastique GRALE scientifique </li></ul> Diapositives: <ul><li> Microscope diapositives SuperFrost PLUS Lomb scientifique Pty Ltd <a href="http://www.lomb.com.au/">http://www.lomb.com.au</a> </li></ul> Résine: <ul><li> Technovit GlycolMethacrylate 7100 Heraeus Kulzer <a href="http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm">http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm</a> </li><li> Sauvegarde bloc de résine-Technovit 3040 blocs Histo Heraeus Kulzer </li></ul> Taches (Réactifs provenant GRALE scientifique) Trichrome de Goldner tache </li> 1. De fer selon Weigert hemotoxylin (DeGroat) <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) Solution Hemotoxylin </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 1g </td></tr><tr><td> Alcool absolu </td><td> 100mL </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) Solution de fer </td></tr><tr><td> Aqueuse à 30% de chlorure ferrique </td><td> 4mL </td></tr><tr><td> L&#39;acide chlorhydrique (concentré) </td><td> 1ml </td></tr><tr><td> Eau distillée </td><td> 95ml </td></tr></table> Filtrée et ajoutée à un volume égal de hemotoxylin immédiatement avant teinture utilisée. 2. Ponceau-fuchsine-azophloxin solutions de stock <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) Ponceau de xylidine solution </td></tr><tr><td> Ponceau de xylidine </td><td> 0,75 g </td></tr><tr><td> fuchsion l&#39;acide </td><td> 0.25g </td></tr><tr><td> Acide acétique </td><td> 1ml </td></tr><tr><td colspan="2"> mélanger l&#39;eau, et ajouter distillée (100 ml) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) une solution azophloxin </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> L&#39;acide acétique </td><td> 0.6ml </td></tr><tr><td colspan="2"> mélanger l&#39;eau, et ajouter distillée (100 ml) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> c) travail final solution de coloration </td></tr><tr><td> Ponceau-solution de fuchsine </td><td> 5-10ml </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 2mL </td></tr><tr><td> 0,2% de solution d&#39;acide acétique </td><td> 88mL </td></tr></table> 3. Lumière verte Solution <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Green Light </td><td> 1g </td></tr><tr><td> l&#39;acide acétique </td><td> 1ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mélanger et ajouter de l&#39;eau distillée (500 ml) </td></tr></table> 4. Phophomolybdic acide orangé G <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> L&#39;acide phosphomolybdique </td><td> 3g </td></tr><tr><td> Orange G </td><td> 2g </td></tr><tr><td colspan="2"> Dissoudre dans 500 ml d&#39;eau distillée et ajouter le thymol cristal. </td></tr></table> Von Kossa Stain <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> 1% de nitrate d&#39;argent aqueuse </td></tr><tr><td> Thiosulfate de sodium à 2,5% </td></tr><tr><td> 1% de safranine O </td></tr></table> Alcian bleuissement <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Bleu Alcian 8GX </td><td> 1g </td></tr><tr><td> 3% de solution d&#39;acide acétique </td><td> 100mL </td></tr></table> Hemotoxylin et éosine <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) de Harris hemotoxylin </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 2.5g </td></tr><tr><td> L&#39;alcool absolu </td><td> 25mL </td></tr><tr><td> Alun de potassium </td><td> 50g </td></tr><tr><td> l&#39;eau distillée </td><td> 500mL </td></tr><tr><td> l&#39;oxyde de mercure </td><td> 1,25 g OU </td></tr><tr><td> Iodate de sodium </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> L&#39;acide acétique glacial </td><td> 20mL </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) une solution d&#39;éosine </td></tr><tr><td colspan="2"> Eosine produit commercialement a été utilisé. </td></tr></table> Toutes les poudres de teinture tache sont Gurr poudres colorant. Tous les réactifs sont des réactifs d&#39;analyse, et non réactifs de laboratoire Fluorochromes <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Fabricant </td><td> Fluorochrome </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich, Sydney </td><td> Calcéine verte </td><td> C0875 </td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich, Sydney </td><td> Alizarine complexone </td><td> A3882 </td></tr><tr><td> Intervet Australie, Victoria </td><td> Oxytétracycline (Hors médicaments antimicrobiens étagères) </td><td> Nom commercial; Engemycin 100 </td></tr></table>

undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis

Histologie osseuse décalcifiés démontre la micro-architecture du tissu osseux. Il montre à la fois les composants minéralisés et cellulaires de l&#39;os, qui fournit des informations vitales sur le remodelage osseux ou de la formation et la résorption osseuse. Cela a une importance énorme dans une variété d&#39;applications cliniques et de recherche. Il donne de belles images 1 et permet de techniques comme l&#39;évaluation et l&#39;histomorphométrie fluorochrome 2. Analyse fluorochrome est une technique où les colorants fluorescents qui se lient au calcium sont injectés à un point de moment particulier, qui permet de quantifier la quantité de minéralisation à ce moment donné. Histomorphométrie est un processus de quantification des os au niveau microscopique. Exécution histologie osseuse décalcifiés est techniquement difficile, en particulier avec des spécimens de grande taille. Elle exige des variations dans la technique de celles utilisées dans de la paraffine Embedded Standard histologie. Cette vidéo illustre le processus de production de sections de bonne qualité et démontre les difficultés techniques et des méthodes permettant de les surmonter. Préparation de l&#39;échantillon, la fixation et le traitement sont réalisés avec une manière similaire à d&#39;autres tissus mous, mais en raison de la densité et la faible perméabilité de l&#39;os considérablement plus longue de fixation et de délais de traitement sont nécessaires, prenant souvent plusieurs semaines. Embedding est réalisé en utilisant un milieu de support avec une dureté semblable ou égal et la densité de l&#39;os comme le méthacrylate de résines à base de mais, contrairement à l&#39;infiltration de paraffine et d&#39;enrobage, il s&#39;agit d&#39;une étape irréversible. Sectionnement peut être réalisé par broyage qui produit une section plus épaisse, ce qui est optimal pour les études telles que l&#39;analyse fluorochrome. Le mieux est réalisé en utilisant une lame de diamant sur une macrotome. Alternativement, des sections plus minces peuvent être produites pour la microscopie optique et ceci est réalisé à l&#39;aide d&#39;un microtome luge avec une lame très aiguisée. Le microtome luge fournit la force supplémentaire et la stabilité requises pour les grands, les blocs durs. Résine sections intégrées peuvent être colorés avec une variété de taches, qui sont démontrés.

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Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

Histologie osseuse décalcifiés fournit des informations importantes pour une variété d&#39;applications cliniques et de recherche. Il est techniquement difficile, en particulier avec des spécimens de grande taille. Cette vidéo illustre le processus de production de sections de bonne qualité et démontre les difficultés techniques et des méthodes permettant de les surmonter.

Préparation des os décalcifiés pour l&#39;histologie, histomorphométrie et analyse Fluorochrome

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides ...

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27.1K vues.  Monash University. Histologie osseuse décalcifiés fournit des informations importantes pour une variété d'applications cliniques et de recherche. Il est techniquement difficile, en particulier avec des spécimens de grande taille. Cette vidéo illustre le processus de production de sections de bonne qualité et démontre les difficultés techniques et des méthodes permettant de les surmonter.

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The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Recherche

Biologie

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l&#39;analyse du contenu haute de la neurotoxicité

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

ARN<em&gt; In situ</emHybridation&gt; en embryons entiers de montage et histologie Adapté pour les élasmobranches marins

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing bone, they also support the complex process of bone regeneration. This favorable behavior of autografts is attributed to the three characteristics: osteoconductivity, osteogenicity, and osteoinductivity. However, there is another aspect: Bone grafts release a myriad of molecules, including growth factors, which can target mesenchymal cells involved in bone regeneration. The paracrine properties of bone grafts can be studied in vitro by the use of bone-conditioned medium (BCM). Here we present a protocol on how to prepare bone-conditioned medium from native pig cortical bone, and bone that underwent thermal processing or demineralization. Cells can be directly exposed to BCM or seeded onto biomaterials, such as collagen membranes, previously soaked with BCM. We give examples for in vitro bioassays with mesenchymal cells on the expression of TGF-&#946; regulated genes. The presented protocols should encourage to further reveal the paracrine effects of bone grafts during bone regeneration and open a path for translational research in the broad field of reconstructive surgery.

We describe here how to prepare bone-conditioned medium (BCM) and test its activity in vitro.

Os milieu conditionné: Préparation et essais biologiques

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Préparation d&#39;échantillons pour l&#39;analyse de masse Cytométrie

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty (TKA) is a common surgical intervention. Experiments using primary human OA tissues obtained from TKA provide the capability to investigate disease mechanisms ex vivo. While OA was previously thought to impact mainly the cartilage, it is now known to impact multiple tissues in the joint. This protocol describes patient selection, sample processing, tissue homogenization, RNA extraction, and quality control (based on RNA purity, integrity, and yield) from each of seven unique tissues to support disease mechanism investigation in the knee joint. With informed consent, samples were obtained from patients undergoing TKA for OA. Tissues were dissected, washed, and stored within 4 h of surgery by flash freezing for RNA or formalin fixation for histology. Collected tissues included articular cartilage, subchondral bone, meniscus, infrapatellar fat pad, anterior cruciate ligament, synovium, and vastus medialis oblique muscle. RNA extraction protocols were tested for each tissue type. The most significant modification involved the method of disintegration used for low-cell, high-matrix, hard tissues (considered as cartilage, bone, and meniscus) versus relatively high-cell, low-matrix, soft tissues (considered as fat pad, ligament, synovium, and muscle). It was found that pulverization was appropriate for hard tissues, and homogenization was appropriate for soft tissues. A proclivity for some subjects to yield higher RNA integrity number (RIN) values than other subjects consistently across multiple tissues was observed, suggesting that underlying factors such as disease severity may impact RNA quality. The ability to isolate high-quality RNA from primary human OA tissues provides a physiologically relevant model for sophisticated gene expression experiments, including sequencing, that can lead to clinical insights that are more readily translated to patients.

Primary tissues obtained from patients following total knee arthroplasty provide an experimental model for osteoarthritis research with maximal clinical translatability. This protocol describes how to identify, process, and isolate RNA from seven unique knee tissues to support mechanistic investigation in human osteoarthritis.

Prélèvement de tissus et extraction d’ARN de l’articulation ostéoarthritique humaine du genou

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Un test de chimiotaxie amélioré pour l’identification rapide des chimioattractifs rhizobactériens dans les exsudats racinaires

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

Implants de cartilage artificiel pour la régénération osseuse par ossification endochondrale

Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it does not have a mechanism to induce angiogenesis. Implanting artificial cartilage tissue fabricated from MSCs induces angiogenesis and bone formation in vivo via endochondral ossification (ECO). Therefore, this ECO-mediated approach may be a promising bone regeneration therapy in the future. An important aspect of the clinical application of this ECO-mediated approach is establishing a protocol for preparing enough cartilage to be implanted to repair the bone defect. It is especially not practical to design a single mass of grafted cartilage of a size that conforms to the shape of the actual bone defect. Therefore, the cartilage to be transplanted must have the property of forming bone integrally when multiple pieces are implanted. Hydrogels may be an attractive tool for scaling up tissue-engineered grafts for endochondral ossification to meet clinical requirements. Although many naturally derived hydrogels support MSC cartilage formation in vitro and ECO in vivo, the optimal scaffold material to meet the needs of clinical applications has yet to be determined. Hyaluronic acid (HA) is a crucial component of the cartilage extracellular matrix and is a biodegradable and biocompatible polysaccharide. Here, we show that HA hydrogels have excellent properties to support in vitro differentiation of MSC-based cartilage tissue and promote endochondral bone formation in vivo.

Pleins feux sur l’auteur : Améliorer la régénération osseuse grâce à l’intégration du cartilage artificiel vascularisé 

Bone therapy via endochondral ossification by implanting artificial cartilage tissue produced from mesenchymal stem cells has the potential to circumvent the drawbacks of conventional therapies. Hyaluronic acid hydrogels are effective in scaling up uniformly differentiated cartilage grafts as well as creating integrated bone with vascularization between fused grafts in vivo.

Formation osseuse intégrée par ossification endochondrale in vivo à l’aide de cellules souches mésenchymateuses

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it ...