Les anticorps sont couramment utilisés dans les techniques de laboratoire et leurs applications thérapeutiques et diagnostiques se développent rapidement. La caractérisation rapide et précise de liaison antigène-anticorps est d’une importance cruciale pour ces applications. La photométrie de masse mesure rapidement les affinités contraignantes à l’aide de très petites quantités de matériel.
Aucune étiquetage ou immobilisation n’est nécessaire et des informations sur l’oligomérisation et la pureté des protéines peuvent être obtenues à partir de la même expérience. Ce protocole peut être utilisé non seulement pour étudier les anticorps, mais aussi pour mesurer de fortes liaisons protéines-protéines pour les protéines dont la masse moléculaire est supérieure à 50 kilodaltons. Commencez par utiliser des forceps à pointe molle et lavez les bouteilles pour rincer séquentiellement 24 par 50 millimètres de couvertures de haut en bas avec de l’eau distillée, de l’éthanol, de l’eau distillée, de l’isopropanol et de l’eau distillée.
Après le dernier lavage, séchez les couvercles avec un jet d’azote propre dans la même direction pour éviter de transférer la contamination par les forceps. Rincer 24 couverts de 24 millimètres avec de l’eau distillée et de l’éthanol comme démontré, suivi du séchage avec un jet d’azote propre. Après séchage, déposer un couvercle de 24 par 24 millimètres sur un morceau de papier d’aluminium et placer des bandes de ruban adhésif à double face sur le coverslip.
Ensuite, coupez le coverslip de 24 par 24 millimètres de la feuille et appuyez doucement sur le papier d’aluminium sur le côté de travail de la couverture de 24 par 50 millimètres. Pour préparer des échantillons d’anticorps-antigènes pour les mesures d’affinité, filtrez au moins deux millilitres de PBS à travers un filtre à seringues de 0,22 micron pour éliminer les particules de poussière et les agrégats, et centrifugez les stocks d’anticorps et d’antigènes d’intérêt. Mesurer l’absorption UV de 280 nanomètres des stocks d’anticorps et d’antigènes pour déterminer leurs concentrations réelles et préparer une série de mélanges anticorps-antigènes à la gamme appropriée de concentrations d’antigènes dans un volume final de 50 microlitres par échantillon.
Puis incuber les mélanges antigène-anticorps pendant environ 10 minutes à température ambiante pour permettre à la réaction de liaison d’atteindre l’équilibre chimique. Pour évaluer l’affinité anticorps-antigène par photométrie de masse, appliquez une goutte d’huile d’immersion au microscope sur l’objectif de l’instrument et placez la chambre d’écoulement sur le stade du microscope. Ajouter 10 microlitres de PBS filtré à une extrémité du canal de chambre d’écoulement.
Le tampon entrera dans le canal par action capillaire. Dans l’onglet de contrôle de mise au point du logiciel de collecte de données, utilisez les boutons de mouvement de scène grossier de haut en bas pour effectuer les ajustements initiaux et cliquez sur la netteté pour afficher la lecture du signal de netteté. Utilisez les boutons d’ajustement de haut en bas fins pour maximiser la valeur de netteté et cliquez sur définir la mise au point et la mise au point de verrouillage pour activer la fonction de suivi de mise au point.
Une image d’une diapositive propre doit avoir une valeur de signal égale ou inférieure à 0,05 %Chargez 20 microlitres du premier échantillon d’antigène comme démontré, buvant le liquide de l’autre extrémité avec un petit morceau de papier buvard. Immédiatement après le chargement, cliquez sur enregistrer pour obtenir le nombre approprié d’images équivalent à 100 secondes de données. À la fin de la période de collecte de données, entrez un nom de fichier pour les données et cliquez sur OK, puis échantillon pour enregistrer le fichier.
Pour analyser les données de photométrie de masse, ouvrez le fichier d’intérêt et cliquez sur analyser. Cliquez sur charge pour charger la fonction d’étalonnage et cliquez sur fichier et enregistrer les résultats afin d’enregistrer les données analysées. Pour obtenir les concentrations relatives de chaque espèce dans l’échantillon, ouvrez les événements.
fichier csv, copier les données dans la colonne M dans le logiciel de traçage et d’analyse approprié, et utiliser la fonction histogramme statistiques intrigue pour tracer la distribution de masse moléculaire. Double-cliquez sur l’histogramme pour ouvrir la fenêtre des propriétés de la parcelle, désactiver le binning automatique, et sélectionnez une taille de bac de 2,5 kilodaltons. Pour créer les centres de bacs et les données de compte, cliquez sur appliquer et aller.
Pour adapter l’histogramme aux fonctions gaussiennes, sélectionnez les centres de bac et compte les colonnes et cliquez sur les pics d’analyse et la fonction de menu de pointe multiple de base. Double-cliquez pour indiquer les positions approximatives de pointe sur le tracé de distribution et cliquez sur l’ajustement NL ouvert. Vérifiez les cases à cocher fixes pour les centres de pointe XC et définissez leurs valeurs aux masses moléculaires attendues de l’anticorps libre et des complexes d’antigènes-anticorps simples et doubles.
Vérifiez l’option de partage pour les paramètres de largeur et cliquez sur ajustement. Les valeurs de hauteur maximale ajustées des composants gaussiens représentent la concentration relative de chaque espèce dans l’échantillon. Utilisez ensuite l’équation pour calculer la fraction de concentration de chaque espèce à partir des valeurs de hauteur maximale.
Pour calculer les constantes d’équilibre à l’aide d’un programme de feuille de calcul, ouvrez le calcul de la dissociation. feuille de travail xlsx. Dans cette feuille de travail, les valeurs cellulaires surlignées jaunes dans les lignes 1 à 10 peuvent être modifiées pour effectuer les calculs constants d’équilibre.
Entrez les valeurs constantes de dissociation estimées dans les unités nanomolaires dans les cellules B1 et B2. Si les valeurs constantes de dissociation estimées ne sont pas connues, laissez les valeurs par défaut dans les cellules B1 et B2 inchangées. Entrez les concentrations totales d’anticorps et d’antigènes totaux dans les unités nanomolaires dans les cellules D2 et E2 et entrez les valeurs calculées de fraction pour chaque espèce dans les cellules F2, G2 et H2. Lors de l’analyse globale de la titration, ajoutez les valeurs de fraction de données appropriées dans les lignes 2 à 10. Dans la fenêtre paramètres solveur, sélectionnez la cellule B15 pour la boîte objective définie et les cellules B1 à B2 pour la boîte de cellules variables en changeant.
Sélectionnez le bouton min pour l’option et vérifiez la case à cocher non négative des variables non contraintes, puis sélectionnez GRG non lignear comme méthode de résolution et cliquez sur résoudre. Les valeurs constantes de dissociation les mieux adaptées seront indiquées dans les cellules B1 et B2. Et la somme finale des erreurs au carré sera affichée dans la cellule B15. Dans cette expérience représentative, une série de titration avec l’anticorps anti-humain de thrombine à une concentration humaine fixe de 25 nanomolaires et 0, 7.5, 15, 30, 60, et 120 concentrations humaines nanomolaires d’alpha-thrombine ont été exécutées pour obtenir les distributions moléculaires de masse des mélanges d’antigène-anticorps et de l’échantillon seulement d’anticorps.
Les paramètres de hauteur maximale les mieux adaptés des composants gaussiens ont été normalisés pour obtenir des fractions de concentration d’espèces. Les valeurs de fraction de concentration étaient alors adaptées globalement pour obtenir les affinités de liaison d’antigène-anticorps. Les fractions expérimentales de concentration et les résultats d’ajustement global pour l’anticorps libre, le complexe simple d’antigène-anticorps, et le complexe double d’antigène pourraient alors être tracés.
Pour obtenir des valeurs de KD précises, les concentrations de protéines doivent être soigneusement sélectionnées pour peupler toutes les espèces de réaction. Nous vous recommandons de préparer une série de titrations à l’aide d’une gamme de concentrations d’antigènes. Après ajustement des données, la méthode de projection d’erreur peut être utilisée pour obtenir l’erreur de montage, mais il est préférable de répéter l’expérience et de calculer les écarts types des valeurs moyennes d’affinité de liaison.
