Notre méthode permet d’étudier la cinétique d’une formation complexe protéique. Il décrit à quel point un complexe protéique est serré, et si la formation complexe protéique est perturbée par d’autres protéines. Cette technique permet d’étudier l’interaction protéine-protéine de manière quantitative en utilisant la fluorescence en tant que journaliste, notre analyse peut surveiller l’association et la dissociation d’un complexe protéique en temps réel.
Pour commencer, concevez l’analyse FRET en commençant par les données du complexe COL1 CAND1 à partir de la base de données sur les protéines. Chargez la structure dans PyMOL, puis allez au menu assistant et utilisez la fonction de mesure pour estimer la distance entre le premier acide aminé de CAND1 et le dernier acide aminé de COL1. Ensuite, chargez la visionneuse de spectres en ligne et visualisez simultanément les spectres d’excitation et d’émission de 7-amino-4-méthylcoumarin et FlASH.
AMC est le donneur fret et FlASH est l’accepteur fret. Préparez les cellules avec la protéine donneur FRET en suivant le protocole texte qui l’accompagne. Ensuite, purifiez le complexe COL1 sortease RBX1 en ajoutant d’abord 50 millilitres de tampon de lyse à une pastille de cellules E.Coli exprimant le complexe COL1 sortase RBX1.
Glacer les cellules sur la glace avec une sonication à 50% d’amplitude. Alternez la puissance pendant trois minutes de sorte qu’elle soit une seconde dessus, puis une seconde éteinte pour éviter la surchauffe de l’échantillon. Transférer la cellule résultante dans un tube de centrifugation de 50 millilitres et enlever les débris cellulaires par centrifugation à 25 000 fois g pendant 45 minutes.
Ensuite, ajoutez le supernatant à cinq millilitres de perles de glutathion et incubez-les à quatre degrés Celsius pour dégager le lysate cellulaire. Après incubation, centrifugeuse le mélange de lysate de perle à 1500 fois g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, retirez le surnatant.
Ensuite, lavez les perles avec 5 millilitres de tampon de lyse n’ayant aucun inhibiteur de protéase. Après avoir centrifugé la solution, retirer le supernatant. Maintenant, ajoutez trois millilitres de tampon de lyse aux perles lavées et transférez le lisier de perle dans une colonne vide.
À la nouvelle colonne, ajoutez également cinq millilitres de tampon d’élitution, puis incubez la colonne pendant 10 minutes et recueillez l’allongement. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de thrombine à cinq milligrammes par millilitre à l’élitate des perles de glutathion. Après une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius diluer l’échantillon de protéines trois fois avec tampon A.Charger l’échantillon de protéines à un tampon Une colonne de chromatographie d’échange cationrique calibré à zéro point cinq millilitres par minute.
Ensuite, ajoutez un gradient de zéro à 50% du tampon B dans le tampon A pour élucider la protéine avec un débit de 1 millilitre par minute. Ensuite, mettre en commun les fractions d’allongement contenant la protéine donneur FRET et la concentrer jusqu’à deux points cinq millilitres à l’aide d’une membrane d’ultrafiltration avec une coupure de 30 kilodaltons. Maintenant, ajoutez 7-amino-4-méthylcoumarin au c-terminus de COL1 par transpeptidation par triase médiée en changeant d’abord le tampon dans l’échantillon de protéine de donateur de FRET dans le tampon de sortase utilisant une colonne de désalting.
Pour ce faire, équilibrer d’abord une colonne de désaltage avec 25 millilitres de tampon de triase. Ensuite, chargez deux points cinq millilitres de la solution protéine donneur FRET dans la colonne et jetez le flux à travers. Ensuite, élitez l’échantillon avec trois points cinq millilitres de tampon de triase et de recueillir le flux à travers.
Dans 900 microlitres de l’élitate, ajouter 100 microlitres de 600 micromolaire purifié sortase Une solution et 10 microlitres d’un peptide GGGG-AMC de 25 millimères. Incuber le mélange de réaction à 30 degrés Celsius dans l’obscurité pendant la nuit pour générer COL1-AMC-RBX1. Maintenant, chargez tout l’échantillon sur la colonne de chromatographie d’exclusion de taille et émez-le avec un point cinq fois le volume de colonne de tampon.
En fin de compte, mettre en commun les fractions allongées contenant COL1-AMC-RBX1. Suivez le protocole texte pour préparer la protéine accepteur FRET. Bon nombre des étapes sont similaires à la préparation des protéines des donneurs du FRET.
Une fois terminé, préparez la solution FLASH CAND1. Tout d’abord, ajoutez un microlitre de la solution FlASH à 50 microlitres de la solution tetra-cys-CAND1 fraîchement préparée. Bien mélanger les solutions combinées et incuber le mélange à température ambiante dans l’obscurité pendant une à deux heures pour former la solution FlASH CAND1.
Dans 300 microlitres de tampon FRET, ajouter COL1-AMC-RBX1 à une concentration finale de 70 nanomolaires et transférer la solution dans une cuvette. Placer la cuvette dans le porte-échantillon d’un fluoromètre. Excitez l’échantillon avec une lumière d’excitation de 350 nanomètres et numérisez les signaux d’émission de 400 à 600 nanomètres à un nanomètre par incréments.
Ensuite, dans 300 microlitres de tampon FRET, ajouter col1-AMC-RBX1 et FlASH-CAND1 à une concentration finale de 70 nanomolaires. Excitez l’échantillon avec la lumière d’excitation de 350 nanomètres et numérisez les signaux d’émission de 400-600 nanomètres à un nanomètre par incréments. Réglez la lumière d’excitation à 350 nanomètres et utilisez un filtre de passage de bande qui permet à la lumière d’émission de 450 nanomètres de passer et bloque la lumière d’émission de 500 à 650 nanomètres.
Avec les vannes d’échantillon à la position de remplissage connecter une seringue de trois millilitres rempli d’eau. Ensuite, lavez les deux seringues d’échantillon avec de l’eau en déplaçant la seringue de l’échantillon de haut en bas à plusieurs reprises, jetant l’eau une fois terminée. Ensuite, connectez une seringue de trois millilitres remplie de tampon FRET.
Lavez les deux seringues d’échantillon avec le tampon FRET en déplaçant la seringue de l’échantillon de haut en bas à plusieurs reprises, jetant l’eau une fois terminée. Maintenant, connectez une seringue de trois millilitres et chargez la première seringue d’échantillon, seringue A, avec 100 nanomolaires COL1-AMC-RBX1 dans le tampon FRET. Ensuite, tournez la vanne d’échantillonnage à la position d’entraînement Aussi, connecter une seringue de trois millilitres à la seringue B et charger la seringue B avec 100 nanomolaires de FlASH CAND1 dans le tampon FRET et tourner sa valve à la position d’entraînement.
Ouvrez le panneau de commande en cours d’acquisition dans le logiciel et enregistrez l’émission de COL1-AMC au cours de 60 secondes. Ensuite, prenez un seul coup. Adaptent la diminution et les signaux fluorescents mesurés au fil du temps de chaque prise de vue à une seule courbe exponentielle.
Lavez le système comme indiqué précédemment, puis ajoutez une solution de 100 nanomolaire COL1-AMC-RBX1 et 100 nanomolaire FlASH CAND1 dans le tampon FRET en seringue A.Connectez-le au système pendant qu’il est dans la position de remplissage Seringue de charge A, puis tournez la vanne de l’échantillon à la position d’entraînement. Ensuite, chargez une solution de Skp1-Skp2 dans la seringue B.Connectez-la au système pendant qu’elle est en position de remplissage. Chargez la seringue B, puis tournez l’échantillon vers la position d’entraînement.
Dans le logiciel, allez acquérir et ouvrez le panneau de contrôle. Configurer le programme pour enregistrer l’émission de COL1-AMC sur 30 secondes. Ensuite, prenez un seul coup.
Les signaux de fluorescence augmentent au fil du temps après le mélange des solutions de seringue A et de seringue B.Lorsque 70 nanomolaires de COL1-AMC et flash CAND1 ont été mélangés pour générer fret, deux pics d’émission étaient présents dans les spectres d’émission. Et le pic de COL1-AMC est devenu plus bas, et le pic de FlASH CAND1 est devenu plus élevé. Lorsque la cand1 pleine longueur a été utilisée pour fret le pic de donneur a montré une réduction de 10% de l’intensité.
Toutefois, lorsque CAND1 avec sa première hélice tronquée a été utilisée, la réduction de l’intensité maximale des donneurs a été portée à 30 %, ce qui suggère une efficacité accrue du FRET Pour confirmer que les changements de signal étaient dus au FRET entre COL1-AMC et FlASH CAND1, le fret donateur a été mélangé à un excès non étiqueté CAND1 connu sous le nom de Chase in the acceptor. Par conséquent, le pic des donneurs a été entièrement rétabli et le pic de l’accepteur a été diminué. Il est indiqué ici une parcelle de la valeur K moyenne observée avec la concentration CAND1 suite à une analyse linéaire de régression.
Pour mesurer la constante du complexe, 50 nanomolaires COL1-AMC ont été utilisés dans une série de constantes observées de taux de dissociation ont été mesurées en mélangeant 50 nanomolaires COL1-AMC avec des concentrations croissantes de FlASH CAND1. Semblable à la mesure de la constante, la constante de dissociation observée de COL1 et CAND1 a été trouvée en surveillant la restauration du signal du donneur au fil du temps sur le fluoromètre à débit arrêté. Ici, le signal du donneur a augmenté rapidement et il a révélé une valeur K observée de zéro point quatre par seconde.
En revanche, lorsque le tampon a été ajouté au complexe préassemblé, aucune augmentation du signal n’a été observée suggérant que la dissociation rapide de COL1 CAND1 a été déclenchée par Skp1 Skp2. Assurez-vous de minimiser la quantité de lumière à laquelle le donneur et les protéines accepteurs sont exposés. Essayez de garder les fluorophores dans l’obscurité autant que possible.
