L’utilisation des AAA-ATPases pour éliminer les protéines d’une bicouche lipidique est un thème commun dans le contrôle de la qualité des protéines. Une compréhension mécaniste de ce processus essentiel nécessite un système reconstitué. Les reconstitutions précédentes avec des AAA-ATPases étaient complexes et hétérogènes.
Notre système est simple et entièrement défini. Cela nous permet de manipuler l’AAA-ATPase Msp1, le substrat et l’environnement lipidique. Pour commencer, ajoutez un tampon de reconstitution préalablement préparé, des protéines et des liposomes Msp1 et TA purifiés dans un tube PCR, puis incubez le mélange sur de la glace pendant 10 minutes.
Pendant l’incubation, coupez l’extrémité d’une pipette P200 à environ 1/8 de pouce de diamètre. Ensuite, vortexez soigneusement le tube contenant bioBeads pour obtenir un mélange uniforme. Ensuite, retirez rapidement le couvercle et utilisez la pointe de pipette P200 coupée pour transférer un volume approprié des billes dans un tube PCR vide.
Une fois l’incubation de 10 minutes pour la reconstitution terminée, à l’aide d’une pointe de pipette non coupée, retirez tout le liquide des BioBeads. Ensuite, transférez 100 microlitres de la reconstitution dans le tube avec les BioBeads et laissez-le tourner sur une roue pendant 16 heures. Le lendemain, faites tourner le tube dans un PicoFuge pour granuler les billes, puis transférez le matériau reconstitué dans un tube PCR propre et maintenez le tube sur la glace.
Pour éliminer les protéines qui n’ont pas réussi à se reconstituer dans les liposomes, équilibrez les colonnes de spin du glutathion avec un tampon d’extraction, ce qui implique généralement trois cycles de lavage avec 400 microlitres de tampon, suivis d’une centrifugation pour éliminer le tampon. Ensuite, ajoutez cinq micromoles de chaque chaperon au matériau reconstitué, suivis de 100 microlitres de tampon d’extraction, ce qui porte le volume à 200 microlitres. Ajoutez ce mélange aux colonnes de spin de glutathion équilibrées, puis branchez les colonnes de spin et faites-les pivoter pendant 30 minutes, permettant aux chaperons de se lier à la résine.
Après la rotation, faites tourner brièvement les colonnes. Recueillir le flux traversant, qui est le matériau pré-nettoyé appauvri en protéines agrégées. Placez-le sur de la glace et passez directement au test d’extraction.
Préparez les tubes pour l’analyse SDS-PAGE. Ajoutez 45 microlitres d’eau distillée double au tube d’entrée, 40 microlitres d’eau au tube d’écoulement et 16,6 microlitres de tampon de chargement 4X SDS-PAGE à chaque tube. Pour le test d’extraction, préparez la réaction d’extraction et portez le volume final à 200 microlitres avec le tampon d’extraction.
Ensuite, préchauffer le test d’extraction dans un bloc thermique de 30 degrés Celsius pendant deux minutes. Pour initier le test, ajoutez de l’ATP à une concentration finale de deux millimoles. Faites tourner le tube pendant cinq secondes dans un PicoFuge et incubez-le à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Pendant l’incubation, prélever un échantillon de cinq microlitres de la réaction et l’ajouter au tube d’entrée. De plus, équilibrez une colonne de spin de glutathion pour chaque échantillon dans le test d’extraction, comme démontré précédemment. Une fois l’incubation de 30 minutes terminée, ajoutez 200 microlitres de tampon d’extraction au tube, ce qui porte le volume total à 400 microlitres.
Ensuite, ajoutez cette réaction à la résine de glutathion équilibrée et laissez-la tourner pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après la rotation, faites tourner les colonnes pour recueillir l’écoulement, puis prélevez un échantillon de 10 microlitres pour le tube traversant. Lavez la résine deux fois avec 400 microlitres de tampon d’extraction, en éliminant le flux après chaque lavage.
Après le troisième lavage, maintenez le débit et prenez un échantillon de 50 microlitres pour le tube de lavage. Ensuite, préparez cinq millilitres de tampon d’élution en ajoutant du glutathion réduit à une concentration finale de cinq millimoles dans le tampon d’extraction. Ajouter 200 microlitres du tampon d’élution à la colonne de spin et incuber pendant cinq minutes.
Ensuite, centrifugez la colonne et collectez le flux. Répétez l’étape d’élution une fois de plus. Après la deuxième élution, prélever une aliquote de 50 microlitres de l’échantillon d’élution et l’ajouter au tube d’élute.
Après l’exécution d’un transfert western, l’efficacité d’extraction peut être déterminée en comparant la quantité de substrat dans la fraction élue avec la fraction d’entrée. Le signal dans le flux-through montre une certaine variabilité, mais est généralement similaire à la fraction d’entrée, et il n’y a pas de signal dans la fraction de lavage. En règle générale, il y a une efficacité d’extraction d’environ 10% pour le contrôle positif et une efficacité d’extraction de un à 2% pour le contrôle négatif.
Lorsque les conditions de reconstitution ne sont pas optimisées, les niveaux d’extraction sont comparables entre les échantillons positifs et négatifs. Cette technique a permis à notre laboratoire de tester les propriétés biophysiques du substrat affectant la reconnaissance par Msp1.
