Ce protocole détaillé décrit une méthode très efficace et rentable d’expression bactérienne pour le domaine catalytique recombinant MMP-3 chez E.Coli, qui peut être appliquée à d’autres cibles thérapeutiques MMP. E. coli manque d’un système complexe de repliement des protéines et de traitement post-traductionnel. Cette méthode utilise la souche cellulaire R2DP pour améliorer l’expression de la protéine eucaryote dans E. coli.
La surproduction de MMP spécifiques conduit à plusieurs maladies comme le cancer, les maladies cardiovasculaires et neurodégénératives. Les MMP solubles actifs sont nécessaires au développement de thérapies inhibitrices de la MMP. Inoculer une seule colonie isolée de pET His-tag pro MMP-3 catalytique transformant à partir d’une plaque résistante au chloramphénicol d’ampicilline LB dans cinq millilitres de milieu résistant au chloramphénicol d’ampicilline LB à 37 degrés Celsius.
Conservez les aliquotes de chaque culture et préparez des stocks de glycérol à 40%. Inoculer une fiole d’un litre contenant 500 millilitres de LB ampicilline chloramphénicol résistant à une densité optique de 0,05 à 0,1 à 600 nanomètres avec la culture de nuit. Mesurez la densité optique à 600 nanomètres à plusieurs moments, généralement pendant trois à quatre heures jusqu’à ce qu’elle tombe entre 0,4 et 0,6.
Induire les cultures avec un stock IPTG molaire à une concentration finale d’un millimolaire. Incuber dans le shaker à 37 degrés pendant trois à quatre heures supplémentaires. Centrifugez les cellules dans des bouteilles coniques de 250 millilitres à 13 000 G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes, en répétant jusqu’à ce que les cultures soient entièrement granulées.
Ajouter trois millilitres de tampon de lyse par gramme de granulé et remettre en suspension le granulé par vortex ou pipetage. Ajouter 1,25 millilitre de désoxycholate de sodium de 10 % en poids par volume par litre de culture. Ajouter 10 microlitres de DNase I par litre de culture.
Agiter à température ambiante pendant 30 minutes à 150 tr/min. Centrifuger pendant 10 minutes à 13 000 G et quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant.
Remettez en suspension la pastille dans une culture de 100 millilitres par litre de tampon corporel d’inclusion en pipetant de haut en bas. Conservez les échantillons sur la glace pendant la sonication pour éviter la surchauffe. Soniquez chaque échantillon pendant six cycles de 15 secondes, une sortie de cinq et une impulsion de 50%.
Centrifugez les échantillons pendant 10 minutes à 13 000 G et quatre degrés Celsius. Vérifiez la pastille. Si la pastille est compacte, jetez le surnageant.
Remettez en suspension chaque granulé d’une culture d’un litre et cinq millilitres de tampon de solubilisation. Incuber pendant au moins 30 minutes sur de la glace pour permettre aux protéines de se solubiliser. Centrifuger les cellules pendant 10 minutes à 13 000 fois G à quatre degrés Celsius.
Si la pastille se forme après centrifugation, versez le surnageant dans un tube conique séparé de 50 millilitres. Resuspendez la pastille dans cinq millilitres supplémentaires de tampon de solubilisation par litre de culture en pipetant de haut en bas. Centrifuger pendant 10 minutes à 13 000 G et quatre degrés Celsius.
Ensuite, tirez les surnageants. Jetez la pastille ou conservez-la à moins 80 degrés Celsius pour une sonication supplémentaire. Videz contre le tampon de lavage HT et enregistrez l’A280 de la première fraction de lavage.
Répétez l’opération avec d’autres fractions jusqu’à ce que A280 se rapproche de la ligne de base. Éluez immédiatement les protéines marquées His en ajoutant cinq millilitres de tampon d’élution HT. Recueillir l’écoulement à des fractions de 0,5 à un millilitre dans des tubes de microfuge marqués d’élution HT.
Mesurer l’A280 de la fraction d’élution. Si l’A280 est supérieur à 0,3 milligramme par millilitre, diluer la fraction avec un tampon d’équilibrage HT. Immergez les fractions MMP éluées dans un tube de dialyse dans un litre de tampon de dialyse et remuez le tube et son contenu sur un agitement magnétique pendant au moins huit heures à quatre degrés Celsius.
Transférer dans un litre de tampon de dialyse deux et remuer le tube et son contenu sur un agitement magnétique pendant au moins huit heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, transférer dans un litre de tampon de dialyse trois et remuer le tube et son contenu sur un agitement magnétique pendant au moins huit heures à quatre degrés Celsius. Transférez l’échantillon dans un récipient approprié et étiquetez-le comme MMP composé.
Examinez le tube à la recherche de tout précipité. Par aliquote millilitre d’un milligramme par millilitre MMP, ajouter 50 microlitres d’APMA de 20 millimolaires pour atteindre une concentration apMA finale d’un millimolaire. Si un précipité se forme, centrifugez-le à la vitesse maximale pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Conservez le surnageant dans un tube de microfuge de 1,5 millilitre étiqueté MMP activé. Jeter le précipité dans un récipient marqué pour les déchets APMA. SDS-PAGE a été exécuté pour comparer les fractions d’élution de purification His-tag du domaine catalytique His-tag pro MMP-3 à partir de cellules BL21 DE3 dans les cellules R2DP.
Les huit premières fractions d’élution du domaine catalytique MMP marqué His et des cellules BL21 DE3 ont montré moins de protéines que celles du domaine catalytique MMP marqué His dans les cellules R2DP. Les fractions induites, repliées, concentrées, activées et dessalées des cellules MMP3 CD et R2DP sont montrées. Lors de l’activation, le poids moléculaire de la bande CD MMP-3 activée est d’environ 20 kilodaltons, par opposition au zymogène marqué His qui reste à environ 30 kilodaltons.
Lors de la centrifugation des lysats de cellules, les granulés peuvent ne pas être compacts. Lorsque cela se produit, soniquez plus et centrifugez plus longtemps. Lors de la reconcentration de la protéine, des précipitations peuvent se produire.
Dissoudre dans un tampon de solubilisation et répéter le processus. La procédure décrite ici fournit une méthode détaillée pour l’expression soluble des MMP humains actifs qui peut éventuellement être utilisée pour comprendre le mécanisme moléculaire de l’activité enzymatique MMP. D’autres méthodes de purification des protéines telles que FPLC peuvent être effectuées pour purifier les protéines MMP.
