Koo BK et Mustata RC sont pris en charge par le Sir Henry Dale bourse du Wellcome Trust et Andersson-Rolf A est soutenu par le Medical Research Council (MRC). Fink J est soutenu par le Programme PhD 4 ans Wellcome Trust.

Toutes les souris utilisées dans le protocole suivant ont été conservés dans des conditions exempts d&#39;organismes pathogènes spécifiques, et toutes les procédures ont été effectuées conformément à la réglementation Royaume-Uni du Home Office. Préparation 1 <ol><li> Préparez le support 1 heure avant utilisation (voir le tableau 1 et la liste des matériaux pour plus de détails) et pré-chaud dans un bain d&#39;eau à 37 ° au moins 10 minutes avant utilisation. </li></ol> 2 La culture de l&#39;intestin grêle (SI) organoïdes REMARQUE: Sauf indication contraire, toutes les incubations sont réalisées à 37 ° C, 5% de CO 2 dans un incubateur humidifié. L&#39;équipement et les réactifs venir en contact avec des cellules vivantes doivent être stériles. Pré-chauffer la plaque de culture de tissus est important, car il évite la matrice de sous-sol (Matrigel ou BME) à partir de gouttes d&#39;étalement lors de l&#39;ensemencement. En outre, la matrice de sous-sol doit être conservé sur la glace à tout moment. Conserver à -20 ° C et dégelsur la glace avant utilisation. <ol><li> Isoler Cryptes <ol><li> Pour l&#39;isolement de l&#39;intestin grêle sacrifier la souris selon les règles et réglementations nationales, puis placez l&#39;animal sur son dos et laver l&#39;abdomen avec 70% d&#39;éthanol. Effectuer une incision médiane longitudinale de l&#39;aine jusqu&#39;au sternum. Tout d&#39;abord, couper la peau et du tissu sous-cutané. Retirer l&#39;intestin grêle à partir du caecum à l&#39;estomac. Cryptes isolées du duodénum, ​​le jéjunum et l&#39;iléon peuvent être utilisés pour la culture organoïde. </li><li> Laver le petit intestin isolé avec pré-refroidi une solution saline tamponnée au phosphate sans calcium ou magnésium (PBS0). </li><li> Coupez le tissu dans de longs morceaux de 3-5 cm et utiliser des ciseaux pour couper ouvrir longitudinalement. Étaler le tissu en utilisant une pince. </li><li> Grattez villosités l&#39;aide d&#39;une lamelle. Attention, trop de force provoque le tissu à déchirer et permettra de réduire le rendement des cryptes dans les étapes suivantes. </li><li> Transférer le tissu dans un tube de 50 ml contenant usin PBS0 pré-refroidiPince g. Laver les fragments de tissus par une agitation vigoureuse et changer le PBS0. Répétez 2-3 fois ou jusqu&#39;à ce que le PBS0 tourne moins trouble. </li><li> Incuber le tissu dans un tube de 50 ml contenant 30 ml de PBS0 avec 1 mM d&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pendant 30 min à 4 ° C sur un rouleau de tube. </li><li> Agiter vigoureusement le tube et transférer le tissu à un autre tube de 50 ml contenant 30 ml de PBS0 avec EDTA 5 mM. La solution d&#39;EDTA 1 mM (contenant le tissu précédemment) contient un mélange de cryptes et villosités. Cette fraction ne convient pas pour le semis des organites, car il contient souvent un fort pourcentage de villosités. </li><li> Incuber le tissu supplémentaire pendant 1 heure à 4 ° C sur un rouleau de tube. </li><li> Agiter vigoureusement le tube et recueillir la solution dans un tube de 50 ml propre. Confirmer la présence de cryptes et estimer le nombre, par exemple, en comptant cryptes 50 pi par microscopie optique. Calculez le volume nécessaire pour obtenir 50-100 cryptes et le transférer à un 1,5 ml tube. </li><li> Tourner à 300 g pendant 5 min. Jeter le surnageant, remettre le culot dans 50 ul de matrice de sous-sol, et les graines dans une plaque de 24 puits pré-chauffé. Incuber la plaque dans un incubateur de culture de tissu de 5 à 15 minutes de sorte que la matrice de sous-sol polymérisé. </li><li> Superposition avec 500 ul moyen ENR (voir le tableau 1). Environ 24 heures après l&#39;ensemencement des organites affiche une petite forme kystique ronde et après un autre 2-3 jours herbe structures deviennent visibles. Changer de médias ENR frais tous les 3 jours. </li><li> Passage Organoid cultures tous les 7 jours. </li></ol></li><li> Repiquage et organites maintien <ol><li> Maintenir les organites en actualisant les médias tous les 3 jours et 1 passage: 3 ou 1: 5, comme la lumière se remplit de cellules mortes, environ tous les 7 jours. </li><li> Casser la matrice sous-sol dôme avec un milieu en utilisant 1 ml de pointe Pipetman et transférer du bien à un tube de 1,5 ml. </li><li> Dissocier mécaniquement les organites par pipetage unenviron 50x à l&#39;aide d&#39;une amende (par exemple, 200 pi) pointe. </li><li> Tourner à 300 g pendant 5 min. </li><li> Jeter le surnageant et remettre le culot en 150-250 pi de matrice de sous-sol. Graine d&#39;une pré-chauffé plaque à 24 puits (50 ul de matrice de sous-sol / puits). Avant le semis pipette la matrice de sous-sol de haut en bas une fois pour enrober la paroi de la pointe. Pipette lentement afin d&#39;éviter les bulles et les semences dans le milieu du puits pour empêcher le sous-sol à partir de la matrice de dispersion. Il est souhaitable d&#39;obtenir un dôme de matrice de sous-sol dans le centre du puits. </li><li> Incuber dans un incubateur de culture de tissu pour 5-15 min si la matrice de sous-sol polymérise. Superposition avec 500 ul médias ENR par puits. </li></ol></li></ol> 3 Pré-infection Traitement des SI organites REMARQUE: La figure 1 illustre la procédure de transduction. <ol><li> Bourse ENR à ENRWntNic (voir le tableau 1) moyen et grandir les organites dans tson milieu pendant un minimum de 3 jours ou jusqu&#39;à ce qu&#39;ils aient adopté une morphologie kystique. Wnt3a augmente le nombre de cellules souches et de Paneth tout Nicotinamide (Nic) améliore l&#39;efficacité de la culture. </li></ol> 4. Virus production <ol><li> Un plat de 150 mm de cellules Platinum-E est nécessaire par l&#39;infection. Graine d&#39;environ 5 x 10 6 cellules par ml de milieu de 15 à 18 (DMEM + 10% de FBS) en présence de puromycine (1 ug / ml) et de la blasticidine (10 ug / ml). Transfecter des cellules au bout de 2-3 jours, lorsqu&#39;elles ont atteint 70-80% de confluence. Changer le support de DMEM + 10% de FBS sans puromycine et blasticidine avant la transfection. </li><li> Ajouter 30 mg de construction d&#39;ADN rétroviral, et 240 ul de polyéthylène-imine (PEI) pour séparer des tubes contenant 1 ml d&#39;Opti-MEM. Mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Réunir les deux solutions et laisser incuber à la température ambiante pendant 20 à 30 min. Ajouter le mélange complet au milieu de cellules Platinum-E et agiter prudemment la platee pour assurer une répartition égale des complexes ADN-PEI. </li><li> Incuber les cellules Platinum-E avec le mélange de transfection nuit et rafraîchir le milieu de la journée suivante. Maintenir les cellules dans le nouveau moyen pendant 2 jours. </li><li> Ne recueillir que le milieu dans un tube Falcon de 50 ml, passer à travers un filtre de 0,45 um et centrifuger à 8000 g à 4 ° C pendant 12-16 h. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 250 pi de milieu de transduction (voir le tableau 1). </li></ol> 5. Organoid Fragment Préparation <ol><li> Pour une infection par un puits d&#39;une plaque à 24 puits sont nécessaires. Casser la matrice sous-sol dôme avec un milieu en utilisant 1 ml de pointe Pipetman et le transférer dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Utilisez une pointe de volume plus fine (par exemple, 200 conseils de pi) de perturber mécaniquement les organites par pipetage (30-50x). La solution devient trouble et sans organites entiers doit être visible. </li><li> Centrifuger à température ambiante, 900 g pendant 5 min<html> . </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 500 pl de qualité culture cellulaire protéase recombinante (par exemple, TrypLE). Incuber à 37 ° C pendant 5 min. Après incubation vérifier la taille des fragments organoïdes utilisant la microscopie optique, compter le nombre de cellules par fragment. Fragments contenant 5-10 cellules sont idéales. Si la majorité des fragments contenant un nombre plus élevé de cellules le temps d&#39;incubation peut être augmentée en deux minutes à une heure. </li><li> Terminer le processus de dissociation en ajoutant 500 pi de milieu ENR. </li><li> Centrifuger à température ambiante, 900 g pendant 5 min. Enlever le surnageant et garder le culot sur la glace ou à 4 ° C. </li></ol> 6. rétrovirale transduction <ol><li> Moissonneuse fragments organoïdes avec 250 ul de la solution rétroviral (à partir de la section 4.5) dans un puits d&#39;une plaque à 48 puits. Mélanger doucement par pipetage lent en utilisant 1 ml de pointe Pipetman. </li><li> Sceller la plaque avec du parafilm. </li></ol>e &quot;&gt; 7. spinoculation et placage <ol><li> Centrifuger la plaque à 32 ° C, 600 xg, pendant 1 heure. Retirez délicatement le parafilm et incuber la plaque dans un incubateur de culture de tissu pendant 6 heures. </li></ol> 8. semis de fragments Organoid infectés <ol><li> Transférer les fragments organoïdes infectées et les médias de la transduction du bien à un tube de 1,5 ml, et de spin à 900 g pendant 5 min. </li><li> Jeter le surnageant et remettre le tube contenant le culot sur de la glace pendant 5 minutes pour refroidir. Ajouter 100 ul de matrice de sous-sol et remettre en suspension le culot lentement par pipetage de haut en bas. </li><li> gouttes de semences de «sous-sol matrice -Chargeur mix &#39;50 pi dans une nouvelle plaque de 24 puits. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 5 à 15 min jusqu&#39;à ce que la solidification de la matrice de sous-sol. </li><li> Ajouter des médias de transduction sans polybrene dans les puits et incuber la plaque dans un incubateur de culture de tissu. Changer de support tous les 2-3 jours. </li></ol> 9 Sélection <ol><li> Lancer soilection au bout de 2-3 jours en ajoutant à la puromycine (1 pg / ml) dans les médias. </li><li> Lorsque les fragments commencent à former des organites remplacer le support de transduction avec des milieux ENR supplémenté avec de la puromycine (1 ug / ml). </li></ol> 10 post-infection Traitement des SI organites <ol><li> Culture transduction organites selon le «repiquage et de maintenir organoïdes&quot; protocole (section 2.2.1). Après 1-2 semaines, les organites SI retrouveront leurs structures en herbe. </li><li> Suite à l&#39;apparition de structures en herbe induire l&#39;expression de miARN ou d&#39;ADNc par addition de 4-hydroxytamoxifène (4-OHT) à une concentration de travail de 1 uM. Notez que cette étape n&#39;est valable que si vous utilisez des vecteurs rétroviraux de Addgene (pMSCV-loxp-DsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxp-DsRed-loxp-3xHA-Puro-WPRE (32703), et pMSCV -flip-puro-DsRed-GFP-miARN (32704)) et organites exprimant Cre-ERT2. </li></ol> 11 Confirmation des maladies infectieuses et Expression / répression du gène d&#39;intérêt <ol><li> Si vous utilisez des vecteurs rétroviraux de Addgene (32702, 32703 et 32704) efficacité de transduction peut être confirmée par l&#39;observation d&#39;expression DsRed. En outre, l&#39;expression ou la suppression du gène d&#39;intérêt peut être confirmée par Western Blot, en utilisant la GFP ou de l&#39;épitope 3xHA (pour la surexpression du gène) et la PCR quantitative (par knock-down de gènes), comme illustré en 4 Koo et al. </li></ol>

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology.">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871 (2013).</li><li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo.">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors.">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose. The authors have no conflict of interest declared.

<html> Pour atteindre à haute efficacité de transduction certains aspects sont essentiels. L&#39;un est le pré-traitement des organites avec ENRWntNic médias jusqu&#39;à ce qu&#39;ils adoptent une forme kystique ronde. Cela augmente le nombre de cellules souches et de ce fait la probabilité d&#39;obtenir une intégration stable du transgène, ainsi que l&#39;augmentation du taux des organites SI de survie tout au long de la procédure de transduction. Un autre paramètre est le temps d&#39;incubation suivant spinoculation. Résultats trop courtes ou trop longues incubation à faible efficacité de transduction et faible taux de survie des organites, respectivement. L&#39;étape de spinoculation n&#39;est pas indispensable bien qu&#39;elle augmente de manière significative le pourcentage des organites transduites. Enfin, le virus à titre élevé est essentiel pour la transduction succès. Cela dépend du type de lignée cellulaire d&#39;encapsidation et virus. La combinaison de platine-E lignée cellulaire et le virus de la cellule souche murine (MSCV), a été trouvée pour produire un titre suffisamment élevé pour la transduction des organites. ve_content &quot;&gt; Voici quelques conseils de dépannage qui peut contribuer à réaliser la transduction succès. Tout d&#39;abord, si la transfection de la lignée cellulaire d&#39;encapsidation est pauvre, assurez-vous que la confluence des cellules est comprise entre 70-80% et que le temps d&#39;incubation de la mélange groupé PEI-ADN est compris entre 20 à 30 min. L&#39;survie des organites au cours de la transduction dépend fortement de la taille de fragment. trop longue provoque trypsinisation la majorité des fragments se composer de moins de trois cellules et diminue de ce fait la capacité de survie organoïde. Un autre facteur est l&#39;activité du milieu conditionné Wnt, si l&#39;activité est trop faible stimule à travers plus de CHIR99021 à une concentration de travail de 5 uM peuvent augmenter la survie. CHIR99021 inhibe la GSK3, entraînant la signalisation Wnt augmenté. En outre, Y-27362, qui empêche anoikis est ajouté aux milieux de transduction afin d&#39;améliorer la capacité de survie organoïde, étant donné que les organites sont perturbés fragments de cellules (contenant de 1 à 10) avant la transduction. Comme60; indiqué ci-dessus, la durée d&#39;incubation après spinoculation ne doit pas dépasser 6 heures. Enfin, si pauvre transduction on observe les facteurs mentionnés ci-dessus qui influencent le titre viral et la limite de taille de l&#39;insert pour le vecteur rétroviral doivent être considérés. L&#39;efficacité de l&#39;effet de choc est fortement dépendante de la miARN. Étant donné que l&#39;efficacité varie en fonction de la combinaison du gène cible et il est intéressant de miARN effectuer un écran d&#39;efficacité pour identifier ceux qui donnent les meilleurs résultats. La technique est limitée à des phénomènes épithéliales du système organoïde. Dans le futur, il pourrait être possible d&#39;étudier les maladies infectieuses ou auto-immunes à travers la co-culture des agents pathogènes ou des composants dérivés de reconstitution du système immunitaire, respectivement. Par ailleurs, les rétrovirus ne peuvent effectuer des inserts de taille relativement petite. Par conséquent, les régions régulatrices naturelles doivent être exclus et donc l&#39;expression du transgène ne peuvent pas imiter celui dele gène endogène. Comme mentionné ci-dessus, l&#39;efficacité dépend de knockdown du gène cible et miARN. Si aucun miARN avec une efficacité de knock-down approprié peut être trouvé, il peut limiter l&#39;utilisation de la technique pour ce gène cible particulier. Théoriquement, organites sont compatibles avec toutes les techniques de manipulation standardisés utilisés pour les lignées cellulaires. Transduction rétrovirale a été la première méthode à indiquer 4, et récemment BAC (chromosomes bactériens artificiels) -transgenesis est devenu disponible 5. Avec un temps de production totale de 2 à 3 semaines après la transfection du plasmide viral dans la lignée cellulaire d&#39;encapsidation, il est nettement plus rapide que la génération d&#39;une transgéniques (Tg) de la souris. En maintenant l&#39;in vivo l&#39;architecture crypte-villosité tout en contenant des cellules souches ainsi que toutes les lignées de cellules différenciées de l&#39;épithélium intestinal, le système de culture organoïde fait le pont entre l&#39;animal et tg culture cellulaire utilisé précédemment. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Le protocole décrit ici fournit une méthode pour effectuer l&#39;analyse phénotypique de endodermique épithélium in vitro par intensité forte et déficitaires des études de fonction. Il est donc possible de répondre à des questions physiologiquement pertinents adulte biologie des cellules souches, avec un besoin minimal de souris tg. Par exemple, la génération de souris knock-out conditionnel peut être évité en utilisant des mutants dérivés d&#39;organites nouveau-né avec une létalité périnatale 6. En outre, la technique peut être appliquée à organites provenant de souris knock-out précédemment établies pour étudier le rôle des paralogues en effectuant knockdown supplémentaire 7,8. Suite à la création de petits organites intestinaux, adaptation du protocole de culture d&#39;origine a permis la culture de pancréas, du foie, du colon et de l&#39;estomac épithéliums 9-11. En outre, organites intestinales humaines et organites tumorales ont été obtenues à partir de biopsies humaines normales, primaire adenoma et le cancer colorectal biopsies 10. Le protocole d&#39;infection virale peut facilement être étendue à ces types de organoïdes et fournit un moyen sans précédent de réaliser des études fonctionnelles dans les tissus humains dérivée. Pris dans leur ensemble, transduction rétrovirale de petits organites intestinale est une ressource précieuse pour la recherche d&#39;entretien sur les cellules souches, la différenciation et la décision du destin cellulaire, ainsi que les interactions de signalisation cellulaire et cellules portable.

Haut-débit génétique fonctionnelle est nécessaire pour accroître notre compréhension de la biologie du corps, afin d&#39;améliorer la science fondamentale et la médecine actuelle. la génétique de la souris a été l&#39;étalon-or pour étudier la fonction des gènes in vivo, même si elle est à la fois long et coûteux. Les lignées cellulaires, qui constitue l&#39;autre choix commun, ont une capacité de débit supérieure, tout en étant moins cher. Cependant, ils sont gênés par leur incapacité à reproduire le microenvironnement approprié et par conséquent, les réponses physiologiques vu in vivo. Ainsi, il existe un besoin non ambiguë d&#39;un système de modèle facile à manipuler, ce qui permet de coût / temps efficace analyse à haut débit tout en imitant les réponses physiologiques observés in vivo transgéniques expériences dans (tg) de souris. Pour l&#39;épithélium endodermique un tel système de modèle apparu en 2009 1. Parmi les connaissances acquises à partir de la découverte des cellules souches intestinales LGR5-positifs a étédes informations sur le créneau correspondant à la matrice et des facteurs de croissance extra-cellulaire nécessaires pour le maintien de cellules souches. En utilisant cette information, il est devenu possible d&#39;établir des «mini-tripes» également connu sous le organites 2. Récemment, une nomenclature de consensus pour les cultures in vitro, où organites sont appelés «enteroids», a suggéré 3. Comme les lignées cellulaires, les organites sont en pleine expansion et facile à traiter avec des ligands et inhibiteurs. Cependant, au lieu d&#39;être à deux dimensions sont des structures tridimensionnelles d&#39;auto-organisation qui conservent l&#39;organisation crypte-villosité ainsi que les cellules souches et lignées de cellules différenciées de l&#39;intestin grêle (SI). Organites sont constitués d&#39;une seule couche de cellules épithéliales qui entourent une zone luminale. Structures en herbe en saillie correspondent à de petites cryptes intestinales contenant le compartiment des cellules souches. A partir de la pointe de la structure naissante cellules souches se différencient car ils MIgrille vers l&#39;épithélium, où les cellules différenciées sont excrétés dans la lumière. Par rapport à des lignées cellulaires, ce système ex vivo récapitule plus étroitement la physiologie normale et est donc un système de modèle prometteur pour le petit épithélium intestinal. Dans ce protocole vidéo de transduction rétrovirale, nous présentons une méthode qui permet ex vivo des études de la fonction des gènes dans ce nouveau système de culture organoïde. Nous commencerons par décrire organoïde culture d&#39;une manière pas-à-pas, et continue en démontrant la production de rétrovirus, suivie par la procédure de transduction. Enfin, il ya une section pour des conseils supplémentaires pour le dépannage. Un avantage de cette technique est qu&#39;elle peut être combinée avec l&#39;imagerie en direct ou le criblage de médicaments à étudier l&#39;homéostasie, les décisions du destin cellulaire et interactions cellulaires dans l&#39;épithélium intestinal. En raison de leur architecture simple et taux de rotation rapide, organites représentent un modèle idéal deystème pour l&#39;étude des cellules souches adultes de la biologie. En outre transduction rétrovirale peut être appliquée à organites dérivées de souris transgéniques pré-établies ainsi que des échantillons de patients humains. À l&#39;approche de knock-in et knock-out ne peut être étendue à l&#39;homme, les organites humain SI constituent une alternative intéressante. En résumé, la manipulation génétique par transduction rétrovirale permet l&#39;analyse phénotypique de petits organites intestinales provenant de souris ou des échantillons de tissus humains, complétant ainsi la génétique de la souris et des lignées cellulaires tout en ouvrant de nouvelles voies pour des études dans les tissus humains dérivée. Transduction rétrovirale permet intensité forte et la perte de fonction des études à effectuer dans le système de culture organoïde 4. Cela en fait un outil précieux pour étudier la fonction des gènes, adulte biologie des cellules souches et de la maladie, tout en étant en conformité avec les trois R (réduction, raffinement et remplacement).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">Advanced DMEM/F12&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12634-034</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutamax 100x&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">35050-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Hepes 1M&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin- Streptomycin 100x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">B27 supplement 50x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">N2 supplement 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">n-Acetylcysteine 500 mM&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse EGF 500 &#181;g/ml</td>
			<td>Invitrogen Biosource</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Noggin 100 &#181;g/ml&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">R-Spondin conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wnt conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from L cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nicotinamide 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 10 &#181;M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene 8 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Standard BD Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:595px;">Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) 
			supplied by AMSBIO can be used as an alterntive.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">24 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>662960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">48 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>677980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CHIR99021</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3734-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Platinum- E cells</td>
			<td>Cell biolabs</td>
			<td>RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A1113902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Polyethyleneimine (PEI)</td>
			<td style="width:157px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">opti-MEM</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">TrypLE</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Parafilm</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">4-OHT</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H7904</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture

Cellules souches LGR5 positifs peuvent être complétées par la croissance facteurs essentiels VO, caboche, et R-Spondin, ce qui nous permet à la culture en pleine expansion structures épithéliales 3D primaires in vitro. Les deux propriétés de l&#39;architecture et physiologiques de ces «mini-tripes», également appelés organites, ressemblent beaucoup à leurs homologues in vivo. Cette eux un système de modèle attractif pour le petit épithélium intestinal fait. Utilisation de transduction rétrovirale, génétique fonctionnelle peuvent désormais être effectuées par la surexpression du gène conditionnelle ou effet de choc. Cette vidéo montre la procédure de culture organoïde, la génération de rétrovirus, et la transduction rétrovirale des organites à faciliter l&#39;analyse phénotypique de la petite épithélium intestinal in vitro. Ce système modèle organotypique nouveau en combinaison avec l&#39;expression de gènes à médiation rétrovirale fournit un outil précieux pour l&#39;analyse rapide de la fonction des gènes in vitro sans qu&#39;il soit nécessaire de costlgénération y et chronophage pour les animaux transgéniques.

Organites sont prêts à être divisé lorsque la lumière centrale est obscurcie par la présence de cellules mortes (figure 2). Après 2-3 jours de organoïdes pré-traitement devrait adopter une morphologie ronde kystique (Figure 3). Cela augmente le nombre de cellules souches, en améliorant les chances d&#39;obtenir une intégration stable. La taille de la pastille virale peut varier suivant la centrifugation du surnageant viral, probablement en raison de la contribution variant de débris cellulaires de la taille des pellets. Aucune corrélation claire de l&#39;efficacité de transduction a été observé. Au cours de la procédure de sélection organites non transduites vont mourir, tandis que ceux ayant une intégration stable est conservé. La protéine fluorescente à partir de rétrovirus MSCV-eGFP peut être observée dans des cellules provenant de survivants organites, qui ont une morphologie kystique, dans les 2-3 jours après transduction (figure 4). <img alt<html> = &quot;Figure 1&quot; fo: contenu width = &quot;6 pouces&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figure 1: Une représentation schématique de la procédure de transduction rétrovirale. Organites Avant d&#39;infection sont pré-traitées en utilisant ENRWntNic jusqu&#39;à ce qu&#39;ils adoptent une structure kystique (étape 1). Platine cellules-E sont utilisées comme la lignée cellulaire d&#39;encapsidation, et sont mises en culture jusqu&#39;à ce qu&#39;elles atteignent 70-80% de confluence. Par la suite, ils sont transfectées avec la construction rétrovirale utilisant PEI. Les virus sont récoltées 2 jours plus tard (étape 2). Organites sont traitées à la trypsine pour obtenir des fragments contenant 1-10 cellules (étape 3), et sont ensuite infectées (étape 4). À la suite de spinoculation à augmenter l&#39;efficacité de l&#39;infection (étape 5), les fragments sont ensemencées organoïdes infectés (étape 6) et 2-3 jours après la sélection de clones positifs avec intégration stable peut être réalisée (étape 7). 1765fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figure 2: Représentant l&#39;image de organoïdes après 4-6 jours de culture. La lumière est remplie de cellules mortes, faisant apparaître sombre. Organites à ce stade sont prêts à être des passages. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3 images représentant des petits organites intestinales cultivées en ENRWntNic médias pendant 3-4 jours. Les organites adopter une morphologie kystique. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4 images représentant des petits organites intestinales (a) qui montrent l&#39;expression du transgène viral (b, eGFP). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Advanced DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> Conserver à 4 ° C pendant 4 semaines </td></tr><tr><td> Avancée DMEM / F12 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Glutamax 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Hepes 1 M </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Antibiotiques 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Moyen ENRWntNic (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Conserver à 4 ° C pendant 2 semaines </td></tr><tr><td> Avancée DMEM / F12 +++ </td><td> 7,2 ml </td></tr><tr><td> complément B27 (50x) </td><td> 400 pl </td></tr><tr><td> N2 supplément (100x) </td><td> 200 pl </td></tr><tr><td> N-acétylcystéine (500 mM) </td><td> 50 pi </td></tr><tr><td> EGF de souris (500 ug / ml) </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> Caboche souris (100 ug / ml) </td><td> 20 pl </td></tr><tr><td> R-Spondin conditmoyen ioned </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Wnt3a milieu conditionné </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Nicotinamide (1 M) </td><td> 200 pl </td></tr><tr><td colspan="2"> moyen de transduction (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Préparer une solution fraîche </td></tr><tr><td> Moyen ENRWntNic </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Y-27 632 (10 uM) </td><td> 20 pl </td></tr><tr><td> Polybrène (8 pg / ml) </td><td> 20 pl </td></tr><tr><td colspan="2"> Moyen ENR (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Conserver à 4 ° C pendant 4 semaines </td></tr><tr><td> Avancée DMEM / F12 +++ </td><td> 17,4 ml </td></tr><tr><td> complément B27 (50x) </td><td> 400 pl </td></tr><tr><td> N2 supplément (100x) </td><td> 200 pl </td></tr><tr><td> N-acétylcystéine (500 mM) </td><td> 50 pi </td&gt; </tr><tr><td> EGF de souris (500 ug / ml) </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> Caboche souris (100 ug / ml) </td><td> 20 pl </td></tr><tr><td> R-Spondin milieu conditionné </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Médias pour les cellules Platinum-E (pour 500 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Conserver à 4 ° C pendant 12 semaines </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449,45 ml </td></tr><tr><td> Sérum bovin fœtal (FBS) </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Puromycine (1 ug / ml) </td><td> 50 pi </td></tr><tr><td> Blasticidine (10 ug / ml) </td><td> 500 pl </td></tr></tbody></table> Tableau composition 1. Médiathèque avancée DMEM / F12 +++, moyen ENRWntNic, le milieu de transduction, moyen ENR, et moyen pour les cellules Platinum-E.

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A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Ce protocole explique culture organoïde primaire LGR5-positve et la performance ultérieure de transduction rétrovirale. Cela permet la surexpression Cre inductible ou effet de choc du transgène livré et permet des études fonctionnelles à réaliser dans le roman en organotypique in vitro système modèle.

Un protocole de vidéo infections rétrovirales dans intestinale primaire Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

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Research

JoVE Journal

Biology

29.5K vues.  University of Cambridge.  Ce protocole explique culture organoïde primaire LGR5-positve et la performance ultérieure de transduction rétrovirale. Cela permet la surexpression Cre inductible ou effet de choc du transgène livré et permet des études fonctionnelles à réaliser dans le roman en organotypique in vitro système modèle. 

Vidéo: A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protocole pour la dengue dans les moustiques (Aedes aegypti) et détermination de phénotype d&#39;infection

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Recherche

Biologie

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Culture primaire et l&#39;électroporation plasmidique de l&#39;Organe de Corti murin.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules de foie de rat

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

Rétroviral infection de cellules souches embryonnaires murines dérivées de cellules du corps embryoïdes pour l&#39;analyse de la différenciation hématopoïétique

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and composed of mature enterocytes, goblet cells and enteroendocrine cells; and crypts, residing proximal to the submucosa and the muscularis, harboring adult stem and progenitor cells and mature Paneth cells, as well as stromal and immune cells of the crypt microenvironment. Until the last few years, in vitro studies of small intestine was limited to cell lines derived from either benign or malignant tumors, and did not represent the physiology of normal intestinal epithelia and the influence of the microenvironment in which they reside. Here, we demonstrate a method adapted from Sato et al. (2009) for culturing primary mouse intestinal crypt organoids derived from C57BL/6 mice. In addition, we present the use of crypt organoid cultures to assay the crypt metabolic profile in real time by measurement of basal oxygen consumption, glycolytic rate, ATP production and respiratory capacity. Organoids maintain properties defined by their source and retain aspects of their metabolic adaptation reflected by oxygen consumption and extracellular acidification rates. Real time metabolic studies in this crypt organoid culture system are a powerful tool to study crypt organoid energy metabolism, and how it can be modulated by nutritional and pharmacological factors.

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Small intestinal crypt organoids cultured ex vivo provide a tissue culture system that recapitulates growth of crypts dependent on stem cells and their niche. We established a method to assay the metabolic profile in real time in primary mouse crypt organoids. We found organoids maintain physiological properties defined by their source.

Analyse en temps réel de profil métabolique dans<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultures souris intestinale Crypte organoïde

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Un protocole pour Lentiviral transduction et analyse aval de intestinale organoïdes

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolation et culture des kératinocytes de la souris primaire de la peau de souris néonatale et adulte

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

Induction et détection d'apoptosis dans une culture primaire des cellules intestinales de concombre de mer

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

Monocouche épithéliale dérivée d’organoïdes : un modèle in vitro cliniquement pertinent pour la fonction de barrière intestinale

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

Méthodes de culture pour étudier les interactions spécifiques aux apicales à l’aide de modèles organoïdes intestinaux

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...