Pour commencer, utilisez des ciseaux ou des cisailles robustes pour couper l’extrémité du capuchon à 0,5 millimètre du fond conique d’un tube de micro-centrifugation de 1,5 millilitre. Placez un morceau de laine de verre dans le tube coupé pour couvrir le trou central. Placez une unité de filtration en laine de verre assemblée dans un tube de micro-centrifugation stérile de 1,5 millilitre et étiquetez le tube.
Ensuite, découpez une plaque PCR à 96 puits sans jupe en six racks de support à deux colonnes. Retournez les grilles à deux colonnes de manière à ce que les fonds coniques des puits soient orientés vers le haut. Placez la grille dans une boîte de Pétri en verre contenant du papier filtre humide et couvrez-la avec le couvercle pour créer une chambre d’humidité pour les gaines foliaires.
Pour récolter les conidies du Colletotrichum graminicola en sporulation, ajoutez trois à quatre millilitres d’eau stérile déminéralisée dans l’assiette. À l’aide d’un pilon stérile à pointe conique, racler uniformément toute la plaque pour détacher les spores de la gélose. Ajouter de manière aseptique un millilitre de suspension de spores sur une unité de filtration en laine de verre et permettre aux spores de s’écouler dans le tube de collecte par gravité.
Centrifugez la suspension de spores filtrée à 3 500 G pendant cinq minutes et versez le liquide dans un récipient autoclavable. Ajoutez un millilitre d’eau déminéralisée stérile dans le tube de collecte et agitez doucement pour remettre en suspension les spores granulées. Encore une fois, centrifugez la suspension et remettez les spores en suspension pour quantification dans 300 à 500 microlitres d’eau déminéralisée.
Utilisez un hémocytomètre sous un microscope composé à un grossissement de 100 fois pour déterminer la concentration de spores. Préparez ensuite une suspension de 500 000 spores par millilitre avec de l’eau déminéralisée. Pour enlever la gaine de la première vraie feuille des semis de la deuxième semaine.
Passez une vignette le long de la marge qui se chevauche de la gaine et desserrez-la doucement de la goulotte. Coupez la gaine foliaire récupérée en segments de trois à cinq centimètres. Déroulez soigneusement chaque segment pour exposer la couche épidermique interne.
Appliquez 20 microlitres de suspension de spores fongiques sur la surface interne au centre de la gaine au-dessus de la nervure médiane. Placez les gaines foliaires inoculées horizontalement, avec une nervure médiane positionnée en bas, dans une boîte de Pétri en verre contenant du papier filtre humidifié. Ensuite, placez les petites chambres d’humidité dans une boîte de stockage transparente recouverte de papier de germination humidifié, couvrez la boîte de stockage avec un couvercle et incubez à 23 degrés Celsius sous un éclairage continu pendant le temps prévu.
Vérifiez régulièrement les cases pour voir s’il y a des signes de maladie sur les gaines.
