Notre travail est soutenu par la biotechnologie et du Conseil de recherche en sciences biologiques. Nous tenons à remercier le Professeur Tamotsu Yoshimori de bien vouloir nous fournir avec le plasmide pour l&#39;expression de la CFP-LC3.

1. Préparation des cellules <ol><li> Seed faible nombre de passages des cellules HEK-293T exprimant de façon stable GFP-DFCP1 22 lamelles rondes mm, les cellules de culture de la nuit dans du milieu de Dulbecco modifié Eagles (DMEM), à une confluence de 30-40% (objectif pour une confluence de 80% après 2 jours - jour de l&#39;imagerie des cellules vivantes). </li></ol> 2. La transfection cellulaire <ol><li> Préparer le mélange complexe de transfection pour chaque plaque, contenant 100 ul OptiMEM j&#39;ai réduit un milieu sans sérum, 3 pi X-tremeGENE 9 ADN réactif de transfection, et 0,5 ug de pECFP-LC3 ADN plasmidique. Mélanger doucement par pipetage de haut en bas et incuber 15 min à température ambiante. [Note: Nous avons constaté à plusieurs reprises que d&#39;autres réactifs de transfection, comme Lipofectamine 2000 ont beaucoup de toxicité, et, en plus, ils produisent des particules fluorescentes sur leur propre qui interfèrent avec de nombreuses techniques de microscopie.] </li><li> Aspirer le milieu des assiettes et ajouter DMEM frais préchauffé à 37 ° C. </li><li> Ajouter le transfection complexe de cellules par pipetage, les cellules incuber pendant 24 heures. </li></ol> 3. L&#39;incubation des cellules avec le marqueur Organelle (Facultatif) <ol><li> Ajouter Mitotracker / Lysotracker de DMEM à une concentration finale de 75 nM, et garder sur la glace, dans un tube falcon recouverts d&#39;une feuille d&#39;aluminium, le long de toute la journée d&#39;expérimentation, d&#39;éviter l&#39;exposition lumière et du gel répétitif et dégel. </li><li> Retirer une aliquote de 2 ml de la contenant Lysotracker moyen de Mitotracker / et réchauffer à 37 ° C; moyen aspiration de cellules transfectées et les remplacer par Mitotracker / Lysotracker milieu contenant les cellules et incuber pendant 30 - 60 min. </li></ol> 4. Préparation de la chambre d&#39;incubation pour l&#39;imagerie de cellules vivantes (Figure 1) <ol><li> Propreté métal et plastique des joints toriques avec 75% d&#39;éthanol et d&#39;appliquer de la graisse de silicone sur le pourtour de l&#39;anneau torique métallique. </li><li> En utilisant des pinces supprimer la lamelle de la plaque et sécher l&#39;excédent de milieu de la face inférieure de la lamelle couvre-objet,pour éviter de mélanger trop de moyenne avec de la graisse, car cela va augmenter la probabilité de fuite. </li><li> Laisser la lamelle couvre-objet pour reposer sur le rebord de l&#39;anneau torique en matière plastique et en forme le joint torique métallique sur le dessus du joint torique en matière plastique, avec la lamelle prise en sandwich entre les deux, afin de créer une enceinte fermée. </li><li> Remplir la chambre avec le milieu de la plaque et de ce point et encore, d&#39;éviter une incubation prolongée des cellules dans du milieu DMEM sans un agent tampon, pour éviter des changements de pH à produire, en tant que système de tampon de bicarbonate de DMEM nécessite artificielle concentration en CO 2 de 5 à 10% et la concentration en CO 2 de l&#39;air ambiant est beaucoup plus faible. </li></ol> 5. La famine des cellules <ol><li> Mettre la chambre d&#39;incubation sur la platine du microscope. </li><li> Aspirer le milieu complet et laver avec 2 ml de milieu de famine 3 fois, pour s&#39;assurer qu&#39;aucun acides aminés sont restés dans le DMEM, qui finira par inhiber la réponse autophagie; régler l&#39;minuterie ON. </li></ol> 6. Microscopie <ol><li> Un système d&#39;imagerie approprié configuré pour cellules vivantes grand champ épi-fluorescence sera nécessaire. Cela comprendra typiquement un cadre de microscope inversé la recherche de qualité, une intense large spectre de rayonnement synchrotron, miroirs et de filtres spécifiques pour la protéine fluorescente (s) / colorant (s) d&#39;intérêt, un objectif de haute qualité, d&#39;un capteur CCD sensible / sCMOS caméra et une chambre d&#39;incubation. Tous les principaux fabricants de microscopes offrent des systèmes à grand champ complètes approprié pour l&#39;imagerie des cellules vivantes, mais il est également possible de la maison à construire un système utilisant des composants à partir d&#39;une variété de fabricants et de contrôler à l&#39;aide de logiciels open source tels que Micro-Manager ( <a href="http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/" target="_blank">http: / / valelab.ucsf.edu / ~ MM / MMwiki /</a> ). L&#39;aspect le plus important à nos yeux est d&#39;utiliser un système d&#39;une grande sensibilité ainsi que les niveaux d&#39;expression des journalistes fluorescents peuvent être réduites au minimum. </li><li> Selète les cellules appropriées à l&#39;image. <ol><li> Sélectionnez les cellules larges et plats qui permettront aux événements de formation plus autophagosome d&#39;être capturés. En outre, opter pour des cellules qui ont déjà commencé à produire un plus grand nombre de omegasomes. </li><li> Démarrer la capture vidéo après 30 min ou bien en réponse autophagie, afin de capter une plus grande proportion d&#39;événements de formation autophagosome par vidéo. </li></ol></li><li> Imaging. <ol><li> Utilisez un objectif à fort grossissement (100x 1,4 NA). </li><li> Ajuster l&#39;intensité de la lumière d&#39;excitation à 10-20% du maximum afin d&#39;éviter de photo-blanchiment. </li><li> Réglez l&#39;appareil photo (Hamamatsu ORCA ER, la taille de pixel 6,45 um) à 100-500 ms exposition, binning 2x2 et 100 de gain. </li><li> Réglez la vitesse d&#39;acquisition d&#39;image à 1 image toutes les 10 sec. </li></ol></li></ol> 7. Création Montages de autophagosome Formation événements avec ImageJ [Cela peut être fait de manière non systématique en scannant simplement la vidéo fusionnée pour eévents d&#39;intérêt, mais il peut aussi être systématisé comme indiqué ci-dessous.] <ol><li> Piles d&#39;images ouvertes pour le 3 (ou 2) capturés canaux dans ImageJ / Fidji. </li><li> Appliquer vert, rouge et bleu LUT (tables de correspondance) sur le canal correspondant; fusionner 3 couleurs et économisez. </li><li> Dans l&#39;onglet Analyser, sélectionner Outils&gt; ROI gestionnaire ... &gt; Définir, puis sélectionnez une zone aléatoire de taille définie dans la première image de la pile. </li><li> Dans l&#39;onglet Image, sélectionnez deux exemplaires, afin de dupliquer la zone sélectionnée de la pile. </li><li> Dans l&#39;onglet Image, sélectionnez Piles&gt; Assurez-montage ... pour créer un montage provisoire contenant toutes les trames capturées. Analyser tous les cadres dans le montage d&#39;un événement complete de formation autophagosome; conserver des notes de la première et la dernière image de l&#39;événement. </li><li> Dans l&#39;onglet Analyser, sélectionner Outils&gt; ROI gestionnaire ... sélectionner la même zone dans la première image de la pile pour les deux autres couleurs, ainsi que pour l&#39;image de couleurs fusionnée et dupliquer des piles. </li><li> De til onglet Fichier, sélectionnez Nouvelle&gt; Image et définir la largeur en fonction du nombre de pixels initialement sélectionnés à l&#39;aide du gestionnaire ROI, prévu pour une hauteur de 4 fois la hauteur définie dans le gestionnaire ROI plus 3 pixels pour l&#39;espace entre les 3 couleurs et les Tranches fusionné, et défini comme le nombre de cadres dans chaque pile. </li><li> Dans l&#39;onglet Image, sélectionnez Piles&gt; Outils&gt; Insérer ..., puis insérez chaque sous-pile les uns sur les autres, en laissant un espace de 1 pixel entre les deux. </li><li> Dans l&#39;onglet Image, sélectionnez Piles&gt; Assurez-montage ... pour créer un montage de départ et de finition avec la première et la dernière image de l&#39;événement de formation autophagosome capturée. </li></ol>

<ol>
	<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+process+and+function.">Autophagy: process and function.</a> Genes Dev. 21, 2861-2873 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Atg+proteins+in+autophagosome+formation.">The role of Atg proteins in autophagosome formation.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 107-132 (2011).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+from+phenomenology+to+molecular+understanding+in+less+than+a+decade.">Autophagy: from phenomenology to molecular understanding in less than a decade.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 931-937 (2007).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+revisited:+a+conversation+with+Christian+de+Duve.">Autophagy revisited: a conversation with Christian de Duve.</a> Autophagy. 4, 740-743 (2008).</li><li>Yla-Anttilba, P., Vihinen, H., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tomography+reveals+connections+between+the+phagophore+and+endoplasmic+reticulum.">3D tomography reveals connections between the phagophore and endoplasmic reticulum.</a> Autophagy. 5, 1180-1185 (2009).</li><li>Hayashi-Nishino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subdomain+of+the+endoplasmic+reticulum+forms+a+cradle+for+autophagosome+formation.">A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1433-1437 (2009).</li><li>Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+in+vivo+analyses+of+cell+function+using+fluorescence+imaging+(*).">Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*).</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 327-332 (2011).</li><li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+autophagosome+formation+using+Apg5-deficient+mouse+embryonic+stem+cells.">Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells.</a> The Journal of Cell Biology. 152, 657-668 (2001).</li><li>Itakura, E., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+autophagosome+formation+site+by+a+hierarchical+analysis+of+mammalian+Atg+proteins.">Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins.</a> Autophagy. 6, 764-776 (2010).</li><li>Axe, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagosome+formation+from+membrane+compartments+enriched+in+phosphatidylinositol+3-phosphate+and+dynamically+connected+to+the+endoplasmic+reticulum.">Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 182, 685-701 (2008).</li><li>Walker, S., Chandra, P., Manifava, M., Axe, E., Ktistakis, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+autophagosomes:+localized+synthesis+of+phosphatidylinositol+3-phosphate+holds+the+clue.">Making autophagosomes: localized synthesis of phosphatidylinositol 3-phosphate holds the clue.</a> Autophagy. 4, 1093-1096 (2008).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode décrite dans ce protocole permet la visualisation de la localisation d&#39;une protéine pendant la formation autophagosome. Nous avons essayé différentes méthodes de visualisation des événements décrits, y compris point confocale à balayage, la filature disque confocale et Total Internal Reflection Fluorescence de la route (FRBR) de microscopie. Nous avons constaté que pour les fins générales de norme à grand champ épi-fluorescence offre le meilleur compromis entre la sensibilité et la résolu...

L&#39;autophagie est un processus très dynamique, ce qui nécessite la coordination d&#39;un grand nombre de protéines pour le résultat final de formation autophagosome 1-3. La microscopie est probablement la technique la plus couramment utilisée pour étudier l&#39;autophagie 4. La localisation de la plupart des protéines autophagie a été étudiée dans des cellules fixées, tant par immuno-coloration des protéines endogènes et par l&#39;expression de protéines marquées par fluorescence exogène. En outre, la microscopie électronique (EM), seul et en combinaison avec l&#39;étiquetage immuno-or, a décrit les détails les plus fins de ces structures 5,6. Malgré le fait que ces techniques ont mis en place notre compréhension de la formation autophagosome dans les 3 dimensions de l&#39;espace, ils n&#39;ont pas réussi à fournir une quantité suffisante d&#39;informations sur la 4 ème dimension - le temps. Imagerie des cellules vivantes surmonte cet obstacle car il permet de suivre la formation d&#39;un autophagosome aussi proche que possibleble en temps réel 7. Cette technique a été employée la première à étudier l&#39;autophagie par Yoshimori et ses collègues 8, et a été de plus en plus recours à l&#39;avenir. Microscopie time-lapse capte la localisation du point d&#39;intérêt dans des cellules vivantes et sur une période de temps. En comparant ces informations avec un autophagie bien caractérisé et / ou organite marqueur, l&#39;analyse de l&#39;imagerie des cellules vivantes peut mettre le POI dans le contexte spatial et temporel plus élevé de formation autophagosome. Analyse d&#39;imagerie de cellules vivantes sont basées sur la saisie répétitive de la localisation de points d&#39;intérêt le long de toutes les étapes de la formation autophagosome, tandis que l&#39;imagerie de cellules fixées sont basées sur une seule prise. Par conséquent, imagerie des cellules vivantes peut prouver la contribution du POI à des étapes spécifiques de formation autophagosome, tandis que l&#39;imagerie des cellules fixes ne peut assumer le rôle de POI, en fonction de sa localisation moyenne dans de nombreux autophagosomes capturées simultanément à différents stades de leur lifecycle. Bien que l&#39;imagerie des cellules vivantes est une méthode de puissance analytique de haut, il a quelques limitations inhérentes, qui devraient être prises en considération. Tout d&#39;abord, l&#39;imagerie de cellules vivantes nécessite l&#39;expression d&#39;une ou plusieurs protéines marquées par fluorescence exogène. Marqueurs fluorescents ont tendance à être de grande taille et ils peuvent parfois modifier le comportement d&#39;une protéine pour des raisons stériques. Cette situation est accentuée pour des protéines membranaires, comme ils ont besoin pour fonctionner dans l&#39;espace limité des 2 dimensions de membranes. Fait à noter, autophagosomes sont des structures membraneuses, et en conséquence leur formation nécessite un grand nombre de protéines associées à la membrane. Une autre série de problèmes est lié aux niveaux d&#39;expression de la PI. En principe, une protéine exogène doit être exprimée à des niveaux comparables à la protéine endogène. Cela garantit que les régulateurs importants de sa localisation sub-cellulaire ne seront pas saturés, et eanalyse des e sera biologiquement pertinent. En outre, la surexpression de protéines autophagie doit être évitée, car quand ils sont exprimés au-dessus des niveaux endogènes, ils ont tendance à inhiber la réponse autophagie 9. En revanche, puisque les niveaux d&#39;expression de la POI doit être suffisamment élevé pour permettre de suivre sa localisation pour une bonne période de temps sans photo-blanchiment, un compromis doit être atteint. Atteindre les niveaux d&#39;expression optimale d&#39;une protéine exogène dans les cellules mammifères nécessite beaucoup de réglage fin, mais il est possible en établissant et de criblage des lignées cellulaires exprimant de façon stable différents niveaux du POI. La résolution spatiale qui peut être réalisé avec la microscopie à fluorescence standard est un autre facteur limitant. Résolution peut être limitée à un certain nombre de raisons, mais, au mieux, la résolution latérale sera autour de 250 nm. Cela signifie que tous les objets séparés par une distance inférieure à ce apparaîtront connecté (ou comme une seuleobjet) et des objets plus petits que 250 nm seront représentés dans l&#39;image plus grande que ce qu&#39;ils sont réellement. Par conséquent images doivent toujours être interprétés avec cela à l&#39;esprit et des techniques complémentaires telles que l&#39;EM seront nécessaires pour résoudre les petits détails ultra-structurelle. Enfin, l&#39;imagerie de cellules vivantes nécessite intrinsèquement exposition d&#39;une cellule à la lumière, éventuellement pendant une période de temps prolongée. Cela peut modifier les réponses physiologiques d&#39;une cellule, un phénomène connu sous le nom de photo-toxicité. Nous avons utilisé avec succès imagerie des cellules vivantes de la protéine PI3P contraignant DFCP1 de décrire pour la première fois que autophagosomes proviennent de PI3P riches en structures en forme d&#39;anneau omegasomes appelés, qui sont en étroite association avec ER brins 10,11. Nous avons clairement montré que les structures LC3-positifs commencent à se former en association étroite avec omegasomes. Nous suggérons ici que l&#39;utilisation d&#39;une lignée cellulaire stable exprimant la GFP-DFCP1 pour la cellule en directimagerie de la protéine d&#39;intérêt, établit un cadre spatial et temporel robuste pour la caractérisation de son rôle dans la formation autophagosome.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OptiMEM I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985-062</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MitoTracker Red FM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M22425</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-7528</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>6365787001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>22 mm coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0159</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm plates</td>
			<td>Fisher NUNC</td>
			<td>153066</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silicon grease</td>
			<td>RS Components Ltd. </td>
			<td>RS 494-124</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>O-rings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-7816</td>
			<td>Suggested alternative to custom-made O-rings</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Inverted microscope</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 100XO</td>
			<td>N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>ORCA-R2 C10600 10B</td>
			<td>Progressive scan interline CCD</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Illuminator</td>
			<td>TILL Photonics</td>
			<td>Polychrome V</td>
			<td>Ultrafast monochromator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Incubation chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>Cell^R IX81</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SIS xcellence</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live cell imaging of early autophagy events: omegasomes and beyond

Autophagy est une réponse cellulaire déclenchée par le manque de nutriments, en particulier de l&#39;absence d&#39;acides aminés. Autophagy est définie par la formation de structures à double membrane, appelée autophagosomes, qui séquestrent cytoplasme, des protéines à vie longue et des agrégats de protéines, des organites défectueux, et même les virus ou les bactéries. Autophagosomes finalement fusionnent avec les lysosomes entraînant une dégradation majeure partie de leur contenu, les éléments nutritifs produits recyclés vers le cytoplasme. Par conséquent, l&#39;autophagie est essentielle pour l&#39;homéostasie cellulaire, et des dérèglements de l&#39;autophagie peut conduire à la maladie, notamment la neurodégénérescence, le vieillissement et le cancer. Autophagosome formation est un processus très complexe, pour lequel les cellules ont alloué un groupe spécifique de protéines, appelées les machines de l&#39;autophagie de base. Le mécanisme de l&#39;autophagie de base est complété par des protéines fonctionnellement supplémentaires impliquées dans divers processus cellulaires, par exemple dans membrane trafic, en biologie mitochondriale et lysosomale. La coordination de ces protéines pour la formation et la dégradation des autophagosomes constitue la réponse très dynamique et sophistiqué de l&#39;autophagie. Imagerie de cellules vivantes permet de suivre la contribution moléculaire de chaque protéine autophagie liée vers le bas au niveau d&#39;un seul événement de formation autophagosome et en temps réel, par conséquent, cette technique offre une résolution temporelle et spatiale. Ici, nous utilisons une lignée cellulaire exprimant de façon stable GFP-DFCP1, d&#39;établir un contexte spatial et temporel pour notre analyse. DFCP1 marques omegasomes, qui sont des structures précurseurs conduisant à la formation de autophagosomes. Une protéine d&#39;intérêt (POI) peut être marqué d&#39;une croix rouge ou marqueur fluorescent cyan. Différents organelles, comme la ER, les mitochondries et les lysosomes, sont tous impliqués dans les différentes étapes de formation autophagosome, et peuvent être marqués en utilisant un colorant de traçage spécifique. Microscopie time-lapse de autophagy dans ce dispositif expérimental, permet aux informations d&#39;être extrait de la quatrième dimension, c&#39;est à dire le temps. Ainsi, nous pouvons suivre la contribution du POI à l&#39;autophagie dans l&#39;espace et le temps.

Dans le protocole décrit, nous avons utilisé la microscopie time-lapse de suivre la localisation de CFP-étiqueté LC3 dans une lignée cellulaire exprimant de façon stable GFP-étiquetée DFCP1, dans des conditions d&#39;induction de l&#39;autophagie. Le résultat de cette expérience est la capture de 2 séries ou piles d&#39;images, l&#39;une du vert et l&#39;autre du canal bleu, correspondant à la GFP-DFCP1 et CFP-LC3. Nous avons également analysé ces vidéos en utilisant ImageJ, afin de créer des montages co...

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Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Microscopie time-lapse de marqueurs de l&#39;autophagie marquées par fluorescence permet le suivi de la réponse de l&#39;autophagie dynamique avec une haute résolution temporelle. Utilisation de l&#39;autophagie spécifique et marqueurs organites dans une combinaison de 3 couleurs différentes, nous pouvons suivre la contribution d&#39;une protéine à la formation autophagosome dans un contexte spatial et temporel robuste.

Vivre imagerie cellulaire de l&#39;autophagie premiers événements: Omegasomes et au-delà

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

live-cell-imaging-of-early-autophagy-events-omegasomes-and-beyond

Research

JoVE Journal

Biology

18.4K vues.  The Babraham Institute. Microscopie time-lapse de marqueurs de l'autophagie marquées par fluorescence permet le suivi de la réponse de l'autophagie dynamique avec une haute résolution temporelle. Utilisation de l'autophagie spécifique et marqueurs organites dans une combinaison de 3 couleurs différentes, nous pouvons suivre la contribution d'une protéine à la formation autophagosome dans un contexte spatial et temporel robuste.

Vidéo: Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

En direct de l&#39;imagerie Drosophila melanogaster Migrations hémocytaires embryonnaires

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Recherche

Biologie

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET microscopie pour Surveillance en temps réel des événements de signalisation dans les cellules vivantes en utilisant Biocapteurs unimoléculaires

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Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

Deux et trois dimensions imagerie de cellules vivantes de protéines endommagent l&#39;ADN de réponse

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D imagerie de l&#39;agrégation des protéines dans les cellules vivantes

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Autophagy activation is beneficial in the prevention of a number of diseases. One of the physiological approaches to induce autophagy in vivo is physical exercise. Here we show how to activate autophagy by aerobic exercise and measure autophagy levels in mice.

Activation autophagie par exercice aérobie chez la souris

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

Caractérisation de calcification Events Utilisation en direct optiques et Electron Microscopy Techniques dans un tubeworm Marine

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the formation of thrombi that occlude the vasculature and injure organs, with life-threatening consequences. This motivates scientific research on platelet function and the development of methods to track cell-biological processes as they occur under flow conditions.
A variety of flow models are available for the study of platelet adhesion and aggregation, two key phenomena in platelet biology. This work describes a method to study real-time platelet degranulation under flow during activation. The method makes use of a flow chamber coupled to a syringe-pump setup that is placed under a wide-field, inverted, LED-based fluorescence microscope. The setup described here allows for the simultaneous excitation of multiple fluorophores that are delivered by fluorescently labeled antibodies or fluorescent dyes. After live-cell imaging experiments, the cover glasses can be further processed and analyzed using static microscopy (i.e., confocal microscopy or scanning electron microscopy).

This work describes a fluorescence microscopy-based method for the study of platelet adhesion, spreading, and secretion under flow. This versatile platform enables the investigation of platelet function for mechanistic research on thrombosis and hemostasis.

Imagerie en cellules vivantes de la dégranulation et de la sécrétion de plaquettes sous le flux

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Imagerie de cellules vivantes à super-résolution de structures subcellulaires

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment failure is mainly due to the invasiveness of GBM cells, which speaks for the need for a better understanding of GBM motile properties. To investigate the molecular mechanism supporting GBM invasion, new physiological models enabling in-depth characterization of protein dynamics during invasion are required. These observations would pave the way to the discovery of novel targets to block tumor infiltration and improve patient outcomes. This paper reports how an orthotopic xenograft of GBM cells in the zebrafish brain permits subcellular intravital live imaging. Focusing on microtubules (MTs), we describe a procedure for MT labeling in GBM cells, microinjecting GBM cells in the transparent brain of 3 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, intravital imaging of MTs in the disseminating xenografts, altering MT dynamics to assess their role during GBM invasion, and analyzing the acquired data.

We report a technique permitting live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma (GBM) cells invading a vertebrate brain tissue. Coupling the orthotopic injection of fluorescently tagged GBM cells into a transparent zebrafish brain with high-resolution intravital imaging allows the measurement of cytoskeleton dynamics during in situ cancer invasion.

Imagerie en direct de la dynamique des microtubules dans les cellules de glioblastome envahissant le cerveau du poisson zèbre

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...