Commencez par décongeler les supports de soluté congelés ou les pastilles de cellules SLC dans un bain-marie à température ambiante. Préparez le tampon de solubilisation en combinant 135 millilitres de tampon de base et trois comprimés de cocktail d’inhibiteurs de protéase. Une fois les comprimés dissous, remettre la pastille en suspension dans le tampon de solubilisation.
Ajoutez ensuite la désaminase et transférez la suspension dans un homogénéisateur refroidi à la glace. Homogénéisez la solution en déplaçant le piston de haut en bas environ 20 fois, en gardant l’homogénéisateur sur la glace. Ensuite, ajoutez la solution mère de détergent à la concentration finale de 1 %.
Transférez le mélange de solubilisation dans un tube conique de 50 millilitres et tournez-le lentement à quatre degrés Celsius. Au bout d’une heure, centrifugez le mélange et récupérez le surnageant. Équilibrez un volume de lit de quatre à six millilitres de résine streptococcique avec le tampon de base.
Ajoutez ensuite de la résine équilibrée au surnageant solubilisé et faites tourner pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Versez la solution sur une colonne d’écoulement par gravité et laissez la solution s’écouler. Lavez la résine avec 30 fois le volume du tampon de lavage streptocoque en trois étapes égales.
Ensuite, ajoutez trois à cinq millilitres de tampon d’illusion et incubez pendant 15 minutes avant de collecter l’élue. Mesurer la concentration en protéines par spectroscopie absorbant les UV. Combinez les fractions d’illusion souhaitées et ajoutez la protéase 3C.
Faites tourner le tube lentement pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, équilibrez deux à quatre millilitres de volume de lit de résine d’affinité du cobalt métallique avec le tampon SEC. Ajouter la résine d’affinité cobalt métallique équilibrée au mélange de réaction 3C pendant la nuit et tourner à quatre degrés Celsius.
Au bout d’une heure, versez la solution dans une colonne d’écoulement par gravité et collectez l’écoulement. Concentrez le flux dans un filtre centrifuge de coupure de 100 kilodaltons en faisant tourner à 3000g à quatre degrés Celsius. Colonne SEC équilibrée à base d’argos de dextran avec tampon SEC.
Injectez l’échantillon dans la boucle d’échantillonnage et exécutez le programme SEC avec un débit tel que la pression de la colonne soit inférieure aux spécifications du fabricant de la colonne. À l’aide d’un collecteur de fractions, collectez des fractions de 300 microlitres sur l’ensemble du cycle SEC. Après avoir regroupé les fractions de crête, mesurez l’absorbance à 280 nanomètres.
Concentrez ensuite les échantillons au volume requis dans un filtre de coupure de 100 kilodaltons. L’expression initiale de la protéine SLC à petite échelle a été analysée par électrophorèse de page SDS. La microscopie à fluorescence d’A marqué par la GFP SLC a confirmé la localisation de la protéine, spécifique à la membrane plasmique avec une accumulation intracellulaire significative.
La protéine chimiquement et structurellement homogène a donné un seul pic mono dispersé A280 lors de la chromatographie d’exclusion de taille.
