Pour commencer, faire la culture d’hiPSC dans un milieu d’entretien IPSC sur une plaque de culture tissulaire à six puits recouverte d’un gel de matrice extracellulaire à facteur de croissance réduit. Lorsque les cellules atteignent 80 à 90 % v, retirez le milieu de la plaque et lavez les cellules une fois avec du DPBS. Ajoutez ensuite 700 à 800 microlitres d’EDTA à 0,48 millimolaire et incubez pendant une minute à température ambiante.
Retirez la solution de digestion et incubez l’assiette à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Lorsque les cellules sont digérées en feuilles, ajoutez deux millilitres de milieu d’entretien IPSC pour mettre fin à la digestion. Transférez la suspension cellulaire sur une plaque de fixation basse à six puits.
Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et 60 RPM pour former des corps embryonnaires sphériques ou EB. Après 24 heures, à l’aide d’une pipette passée, transférez les EB dans le tube à centrifuger et laissez-le sédimenter pendant cinq à 10 minutes avant de retirer le surnageant. Ajouter le milieu de différenciation MSC dans le tube et transférer les EB sur une lame de fixation basse à six puits avec deux millilitres de milieu de différenciation MSC.
Cultivez les EB sur le shaker à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant sept jours. Le huitième jour, transférez les EB dans le tube à centrifuger comme indiqué précédemment. Une fois les EB sédimentés, retirez le surnageant du tube.
Ajouter le milieu d’entretien MSC dans le tube et transférer les EB dans une plaque à six puits recouverte d’un gel de matrice extracellulaire à facteur de croissance réduit avec deux millilitres de milieu d’entretien MSC. Après l’adhésion cellulaire, changer le milieu jusqu’à ce que la culture atteigne 90 % de confluence. Ensuite, traitez la culture dérivée de l’EB avec une solution de dissociation à 37 degrés Celsius.
Lorsqu’une partie des cellules est digérée en cellules individuelles, ajoutez deux millilitres de milieu d’entretien MSC pour mettre fin à la digestion et transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger. Lavez les cellules non digérées restantes des puits une fois avec du DPBS. Et digérer à nouveau comme démontré précédemment.
Centrifugez ensuite la suspension cellulaire à 250 g pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et ensemencez les cellules dans une plaque de culture enrobée de gélatine. Cultivez les cellules dans un milieu d’entretien MSC à 90 % de confluence avec un changement régulier du milieu.
Lignées de culture hiIPC comme démontré précédemment. Lorsque les cellules atteignent 50 à 60 % de confluence, retirez le milieu d’entretien IPSC de la plaque. Ajouter deux millilitres de produit d’entretien MSC.
Et culture pendant 14 jours à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avec changement quotidien du milieu. Pour la maturation des CSM, traiter la culture monocouche avec une solution de dissociation à 37 degrés Celsius. Lorsqu’une partie des cellules est digérée en cellules individuelles, ajoutez deux millilitres de milieu d’entretien MSC dans les puits pour mettre fin à la digestion et transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger.
Lavez les cellules non digérées restantes une fois avec du DPBS et digérez-les comme démontré précédemment. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire comme démontré précédemment et ensemencez les cellules sur une boîte de culture enrobée de gélatine. Cultivez les cellules dans un milieu d’entretien MSC à 90 % de confluence avec un changement régulier du milieu.
Dans la méthode de formation de l’EB, les colonies de hiIPC présentaient une morphologie compacte avant la différenciation. Après la dissociation, des EB sphériques uniformes se sont formés, qui ont attiré du volume au fil du temps. Par la suite, les EB se sont transformés en cellules monocouches adhérentes atteignant une confluence de 90 % au jour 18 et acquérant une morphologie en forme de fuseau après deux passages.
De même, dans la méthode monocouche, les cellules ont proliféré en formant des cellules adhérentes multicouches. Après avoir été emballées plusieurs fois, les cellules ont mûri en CSM avec une forme de fuseau typique et une colonie tourbillonnante. L’analyse par cytométrie en flux a révélé que les HIIPC étaient positifs pour CD90 et négatifs pour CD34, CD45, CD105 et CD73.
Après différenciation, les HIIPCs pilotant les CSM ont exprimé CD90, CD73 et CD105, tout en restant négatifs pour CD34 et CD45. Les CSM dérivées de monocouches ont montré une formation de dépôts de calcium plus élevée que la méthode EB. Cependant, aucune différence significative n’a été observée dans les capacités de différenciation adipogénique et chondrogène.
Les capacités de prolifération des deux méthodes ont été maintenues jusqu’à 20 passages.
