Murine Bone Marrow Harvest and Isolation for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment

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November 10th, 2023

DOI :

10.3791/200882-v

November 10th, 2023

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Christina M. Kaszuba¹^,², Benjamin J. Rodems¹^,³, Sonali Sharma¹^,³, Edgardo I. Franco¹^,², John M. Ashton¹^,³^,⁴, Laura M. Calvi¹^,⁵, Jeevisha Bajaj¹^,³

¹Wilmot Cancer Institute, University of Rochester Medical Center, ²Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, ³Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, ⁴Genomics Research Center, University of Rochester Medical Center, ⁵Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, University of Rochester Medical Center

Transcription

Pour commencer, retirez le tissu des os de la souris euthanasiée disséquée. Placez les os nettoyés dans une nouvelle plaque à six puits contenant un tampon FACS placé sur de la glace. Transférez les os dans un mortier avec deux à cinq millilitres de tampon FACS.

Broyez les os dans un mouvement circulaire jusqu’à ce que la moelle osseuse soit libérée. À l’aide d’une seringue de trois millilitres, tirez vers le haut et rincez la moelle osseuse pour l’homogénéiser. Tirez l’homogénat dans une autre seringue, puis filtrez-le à travers une crépine de 70 micromètres dans un tube de 50 millilitres.

Rincez les morceaux de tissu de leur filtre dans le mortier avec le tampon FACS avant d’homogénéiser une deuxième fois. Filtrez le tissu rincé comme précédemment. Ensuite, rincez les spicules osseux restants dans le mortier avec un tampon FACS.

Rincez ensuite les morceaux dans un tube de 15 millilitres pour assurer un rendement maximal. Pour digérer la moelle osseuse, centrifugez-la d’abord à 300 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Remettre en suspension la pastille de moelle osseuse dans deux millilitres de mélange de digestion.

Transférez le mélange dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, incubez-le à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes sur un rotateur. Maintenant, ajoutez 10 millilitres de tampon FACS pour arrêter la digestion enzymatique.

Filtrez le mélange à travers une crépine cellulaire de 70 micromètres dans un tube de 50 millilitres. Centrifuger la suspension à 400 G pendant sept minutes à quatre degrés Celsius. Remettre la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de lyse des globules rouges.

Ensuite, ajoutez 10 millilitres de tampon FACS pour arrêter la lyse. Filtrez ensuite le mélange comme précédemment dans un tube de 50 millilitres. Enfin, centrifugez le mélange à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Après avoir éliminé le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 100 microlitres de tampon FACS. Pour la digestion des spicules osseux, il faut d’abord vortex les spicules osseux. Décanter le surnageant et conserver les os au fond.

Ensuite, remettez les spicules en suspension dans un millilitre du mélange de digestion des spicules osseux. Incuber le tube sur un rotateur pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius. Enfin, arrêtez la digestion avec 10 millilitres de tampon FACS.

Filtrer le mélange dans le tube de 50 millilitres contenant de la moelle osseuse lysée et digérée par les globules rouges.

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