Cette méthode peut aider à répondre à quelques questions dans la méthode de champ de malignité sur la caractérisation d’une cellule qui initie une malignité. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une base pour l’analyse fonctionnelle de ces cellules souches cancéreuses. Les implications de cette technique s’étendent à l’endroit où la thérapie des syndromes myélodysplastic ou MDS, car elle peut aider à l’identification des cellules initiatrices de la maladie.
Pour préparer les receveurs au transfert adoptif, une semaine avant la greffe fournir de l’eau stérile complétée par 100 milligrammes par litre de ciprofloxacine aux animaux receveurs congéniques pendant sept jours dans une installation animale spécifique et exempte d’agents pathogènes. Le septième jour, avoir un opérateur de césium 17 formé et certifié a placé l’instrument source de césium pour livrer 70 centigrayS de l’irradiation gamma totale du corps par minute. Placez 10 souris dans un support sur mesure.
Insérez le support dans la chambre irradiateur, livrer 9 gris irradiation totale du corps en 13 minutes. Ensuite, retournez les animaux dans leurs cages. Le lendemain matin, vaporiser 70 pour cent d’éthanol sur un ensemble de deux à six papillons de nuit vieux C57 noir six souris et utiliser des ciseaux pour enlever la peau du bassin aux chevilles.
Utilisez des forceps avec les ciseaux pour enlever le femora et le tibia. Coupez proprement les muscles des os. Couper les extrémités proximales et distales pour le tibia et ramasser un tibia avec des forceps.
Insérez une seringue de trois millilitres munie d’une aiguille de 27 gages dans la cavité de la moelle osseuse et rincez la moelle osseuse dans un tube de fond rond de 14 millilitres contenant 2,5 millilitres de solution saline tamponnée Hanks complétée par un sérum bovin fœtal de 2 % ou HF2. Lorsque toute la moelle a été recueillie, aspirer le tissu plusieurs fois à travers la pointe de l’aiguille de 20 gages pour disperser la masse de moelle en une seule suspension pour le comptage. Pour étiqueter les cellules nucléées de moelle osseuse, ou BMNC, pour le tri d’écoulement, recueillir les cellules par centrifugalisation et suspendre à nouveau la pastille à une fois dix à la septième BMNC par 90 microlitres de concentration de HF2.
Ensuite, ajoutez dix microlitres d’un cocktail biotinylé anticorps anti-lignée à la suspension cellulaire pendant 20 minutes d’incubation à 4 degrés Celsius. Suivi d’un lavage centrifugeuse en trois millilitres de PBS. Suspendre à nouveau la pastille dans 100 microlitres de HF2 par une fois dix à la septième cellule.
Étiquetez ensuite les cellules avec deux microlitres d’anticorps anti biotine conjugué APC. Après 20 minuets à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière, laver les cellules en trois millilitres de PBS frais. Suspendre à nouveau la pastille en HF2 complétée par 0,2 microgramme par millilitre d’iodure de propidium sur la glace.
Calibrez maintenant le trieur de cellules de cytométrie d’écoulement à l’aide de cellules non tachées afin d’optimiser tous les paramètres de tubes, de dispersion et de fluorescence photomultipliers dans la plage linéaire de chaque détecteur. Acquérir trois échantillons de 10 000 cellules pour les cellules étiquetées APC non étiquetées, étiquetées PI et antilité. À la fin du tri, analyser 1000 cellules de chaque échantillon pour confirmer la pureté et la viabilité des cellules triées.
Faites tourner les échantillons dans la centrifugeuse. Puis suspendre à nouveau les granulés dans 0,5 millilitres de HF2 pour le comptage. Pour le transfert adoptif des cellules triées, mélanger 100 microlitres de deux fois le BMNC de type sauvage à partir d’un animal receveur congénique dans le HF2 stérile.
Avec 100 microlitres de deux à cinq fois dix à la quatrième, le donneur trié BMNC d’intérêt dans HF2 stérile dans un tube de micro centrifugeuse par animal receveur. Chargez une seringue d’un millilitre, équipée d’un gage de 28 gages par destinataire avec 200 microlitres de cellules. Ensuite, placez les souris bénéficiaires sous une lampe thermique pour induire la dilatation de la veine de la queue.
Livrer les mélanges cellulaires à chaque animal receveur irradié mortellement par la veine de la queue. Comme l’auto-renouvellement des cellules souches se limite à la lignée négative de type sauvage BMNC, la lignée négative, faible lignée positive, et la lignée élevée cellules positives sont triés et transplantés dans des receveurs de type sauvage pour déterminer la capacité d’auto-renouvellement de chaque population cellulaire. Le BMNC transgénéticien de donneur transplanté d’adoption des animaux modèles de MDS peut être distingué ex vivo par leur expression de marqueur de surface cellulaire CD45.2.
Par 16 semaines après transplantation de la lignée négative BNMC, ou BMNC non triés des animaux transgéniques de donateur de MDS, les cellules transgéniques dehors concurrencent les cellules sauvages-type comme démontré par un pourcentage croissant des cellules positives de donneur de CD45.2, observées dans le sang périphérique des animaux destinataires mortellement irradiés. Ici, les cellules d’une transformation leucémique d’une souris transplantée avec des cellules TRANSGÉNIQUES MDS sont montrées. Notez la présence de nombreuses explosions et formes immatures.
Tout en essayant la procédure, il est important de se rappeler de limiter le temps de manipulation ex vivo, car il peut placer un stress indu sur les cellules, entraînant la mort cellulaire ou la perte fonctionnelle. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs du programme sur le terrain, pour mettre en malignité d’explorer la source de la maladie chez les souris génétiquement modifiées.
