Le protocole décrit permet l’analyse phénotypique des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques de la moelle osseuse et des cellules stromales de la moelle osseuse. Il peut être utilisé pour étudier les perturbations de ces populations dans différents contextes. Par rapport à d’autres méthodes décrites précédemment, cette technique permet l’analyse phénotypique des cellules hématopoïétiques, en particulier dans les deux zones fonctionnelles de la moelle osseuse, endostéale et de la moelle osseuse centrale, ainsi que des cellules stromales de la moelle osseuse.
Pour commencer, placez l’animal euthanasié avec le ventre vers le haut sur une boîte de Petri et vaporisez avec de l’éthanol à 70%. Faites une incision au-dessus de l’abdomen à l’aide de ciseaux et retirez la peau jusqu’aux chevilles. Attrapez l’une des pattes et coupez-la en bas pour la séparer de l’animal à l’aide de ciseaux.
Ensuite, retirez le pied de la jambe en coupant à la cheville et placez la jambe dans du PBS glacé à 2%FBS. Ensuite, saisissez l’os de la hanche à l’aide d’une pince à épiler et coupez-le derrière pour le séparer de l’animal à l’aide de ciseaux. Placez l’os de la hanche dans du PBS glacé à 2%FBS.
Après avoir placé la jambe et l’os de la hanche dans une boîte de Pétri, nettoyez les os à l’aide d’un scalpel stérile. Ensuite, séparez le tibia et le fémur en coupant au genou avec le scalpel et placez les os propres dans du PBS glacé à 2%FBS. Placez le fémur ou le tibia dans un mortier avec du PBS glacé à 2%FBS et écrasez l’os en le pressant doucement contre la paroi du mortier à l’aide du pilon.
Ensuite, pipettez la suspension cellulaire résultante de haut en bas à l’aide d’une pipette de 10 millilitres pour l’homogénéiser et transférez-la dans un tube de 50 millilitres à travers une crépine cellulaire de 40 micromètres placée sur le dessus du tube. Rincez le mortier avec un peu plus de PBS 2%FBS et transférez la solution dans le même tube de 50 millilitres à travers la même crépine cellulaire de 40 micromètres. Centrifuger le tube de 50 millilitres à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension la pastille de cellule dans cinq millilitres de tampon de lyse des globules rouges à température ambiante en remontant et en descendant plusieurs fois. Après une incubation de deux minutes à température ambiante, ajoutez 15 millilitres de PBS 2%FBS et centrifugez le tube de 50 millilitres. Si la pastille de cellule n’a pas l’air rougeâtre, jetez le surnageant, remettez en suspension la pastille dans 200 microlitres de PBS 2% FBS et transférez la suspension de la cellule dans un puits d’une plaque inférieure en V de 96 puits pour la coloration.
Après avoir écrasé l’os comme démontré précédemment, coupez la pointe d’une pipette P1000 à l’aide de ciseaux et utilisez-la pour transférer tout le contenu du mortier dans un tube de 50 millilitres. Ensuite, centrifugez le tube de 50 millilitres à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant, remettre la pastille en suspension dans trois millilitres de collagénase IV et cette solution de dispase-II.
Incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes. Remplissez le tube à 25 millilitres avec du PBS 2%FBS et du vortex à mélanger. Ensuite, transférez le contenu dans un nouveau tube de 50 millilitres à travers une crépine cellulaire de 100 micromètres.
Ajoutez ensuite 15 millilitres de PBS 2%FBS à l’ancien tube de 50 millilitres et transférez la solution dans le nouveau tube de 50 millilitres à travers la crépine cellulaire de 100 micromètres. Après avoir centrifugé et jeté le surnageant, remettre en suspension la pastille de cellule dans cinq millilitres de tampon de lyse des globules rouges en tuypérant de haut en bas plusieurs fois avec une pipette. Après l’incubation de deux minutes à température ambiante, ajouter 15 millilitres de PBS 2%FBS.
Encore une fois, centrifugez le tube et si la pastille de la cellule n’a pas l’air rougeâtre après avoir jeté le surnageant, remettez la pastille en suspension dans 200 microlitres de PBS 2% FBS et transférez la suspension de cellule dans un puits d’une plaque inférieure en V de 96 puits pour la coloration. Ensuite, centrifuger la plaque à 500 G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Placez le fémur sur une boîte de Petri et coupez les extrémités de l’os à l’aide d’un scalpel stérile.
Ensuite, rincer la partie centrale de l’os en faisant passer 100 microlitres de PBS 2% FBS à l’intérieur de l’os une fois de chaque côté à l’aide d’une seringue à insuline de 0,5 millilitre sans volume mort et en recueillant la solution dans un tube microcentrifuge contenant un millilitre de PBS 2% FBS. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres étiqueté comme moelle osseuse rincée contenant quatre millilitres de PBS 2% FBS. Écraser les extrémités de l’os dans un mortier avec du PBS 2%FBS glacé en les pressant doucement contre la paroi du mortier à l’aide du pilon.
Une fois la suspension cellulaire homogénéisée, transférez-la dans un tube de 50 millilitres étiqueté comme moelle osseuse écrasée à travers une passoire cellulaire de 40 micromètres. Enfin, rincez le mortier avec un peu plus de PBS 2%FBS et transférez la solution dans le même tube. L’analyse par cytométrie en flux de cellules souches hématopoïétiques et de progéniteurs multipotents a été réalisée dans la moelle osseuse totale d’une souris C57BL6J jeune adulte en bonne santé.
Dans l’analyse des cellules stromales, des cellules endothéliales et des cellules souches mésenchymateuses dans la moelle osseuse totale, les cellules souches mésenchymateuses peuvent être facilement identifiées en fonction de l’expression des récepteurs de la leptine et les cellules endothéliales peuvent être identifiées en fonction de l’expression de CD31 et SCA-1. Analyse par cytométrie en flux des cellules endothéliales dans la moelle osseuse totale montrant la discrimination entre les cellules endothéliales artériolaires et sinusoïdales sur la base de la GICD1. La quantification des cellules endothéliales de la moelle osseuse artérielle et sinusoïdale dans le tissu central et endostéal de la moelle osseuse montre que les cellules endothéliales de la moelle osseuse artérielle sont plus abondantes dans les régions endostéales, tandis que les sinusoïdes sont plus fréquentes dans les zones centrales de la moelle osseuse.
Lors de l’obtention d’une rougeur de la moelle osseuse, le volume ou le nombre de fois indiqué pour faire passer PBS 2%FBS à travers l’intérieur de la partie centrale de l’os ne doit pas être dépassé. La combinaison de la méthode décrite avec des essais fonctionnels des populations cellulaires analysées phénotypiquement fournirait des informations supplémentaires précieuses sur les perturbations potentielles de ces populations se produisant dans les conditions étudiées. Le protocole décrit permet l’analyse phénotypique des cellules hématopoïétiques différentiellement dans la moelle endostéale et la moelle osseuse centrale, permettant aux chercheurs d’étudier les perturbations de l’hématopiese susceptibles de se produire spécifiquement dans ces emplacements de la moelle osseuse.
