Pour commencer, mélangez la suspension de moelle osseuse murine isolée avec la suspension de spicule osseux. Pipeter 10 microlitres de la suspension cellulaire sur un hémocytomètre pour le comptage. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Ensuite, remettez le granulé en suspension dans 100 microlitres de tampon FACS. Pour colorer les cellules avec des anticorps pour la déplétion magnétique, ajoutez le bloc FC, l’APC CD45 et l’APC TER-119. Lavez ensuite la suspension cellulaire avec un tampon FACS.
Après avoir centrifugé le mélange restant, remettez le granulé en suspension dans 100 microlitres de tampon FACS. Pour colorer la suspension cellulaire avec des microbilles pour l’épuisement magnétique, ajoutez des IgG de souris et des microbilles anti-APC. Incubez le mélange sur de la glace pendant 20 minutes.
Lavez la colonne LD avec deux millilitres de tampon MACS. Mettez à nouveau les cellules en suspension dans le tampon, puis filtrez-les à travers un tube à essai de cinq millilitres avec un capuchon de crépine de cellules de 35 micromètres. Ensuite, placez la colonne LD sur le support du séparateur magnétique et placez un tube à essai de cinq millilitres sous la colonne pour recueillir le matériau élué.
Pipeter la suspension cellulaire dans la colonne LD et recueillir la fraction négative dans le tube à essai. Lavez la colonne deux fois avec un millilitre de tampon MACS et collectez le matériau éluant dans le même tube. Placez la colonne LD sur un nouveau tube à essai de cinq millilitres.
À l’aide d’une pipette, versez trois millilitres de tampon dans la colonne, puis rincez les cellules marquées positivement dans un tube à essai de cinq millilitres. Centrifugez les fractions positive et négative, puis remettez la pastille en suspension dans 100 microlitres de tampon FACS. Pour colorer la fraction négative CD45 TER-119, ajoutez un microlitre de chaque anticorps pour 10 à la sixième cellule.
Placez la suspension sur de la glace pendant 20 minutes. Lavez ensuite la suspension avec deux millilitres de tampon FACS avant de la centrifuger. Ajouter un millilitre de tampon à la pastille et pipeter l’iodure de propidium pour la coloration des cellules vivantes.
Enfin, filtrez l’échantillon à travers une crépine cellulaire de 35 micromètres dans un tube à essai de cinq millilitres avant d’analyser les cellules sur un cytomètre en flux multicolore. Les cellules endothéliales artériolaires se sont significativement développées dans le microenvironnement de la leucémie myéloïde aiguë avec une perte concomitante dans les populations endothéliales sinusoïdales. Une petite expansion des cellules stromales mésenchymateuses a été observée à l’âge de huit semaines.
