Obtenir des organoïdes gastriques humains préalablement préparés pour le profilage du pH. Pour commencer, connectez l’électrode de référence au câble de l’électrode de pH via le connecteur. Ensuite, connectez la microélectrode à l’amplificateur et l’amplificateur à un PC mis à la terre avec le logiciel via un câble USB.
Placez la microélectrode et l’électrode de référence dans de l’eau désionisée pour immerger les deux pointes d’au moins un centimètre dans le liquide. Remplissez des tubes coniques de 50 millilitres avec les tampons d’étalonnage souhaités. À l’aide d’une lingette de laboratoire délicate, épongez doucement le tube de protection avec l’électrode de référence.
Après avoir ouvert le logiciel, sous l’onglet d’étalonnage, sélectionnez la case Y-Zoom, puis réglez la lecture du signal du capteur sur millivolts. En commençant par les électrodes dans le tampon de pH 4,01, entrez 4,01 comme valeur de pH connue. Sélectionnez Ajouter un point une fois que la lecture en millivolts se stabilise, puis remettez les deux électrodes dans de l’eau déminéralisée pour les rincer.
Après avoir répété le processus pour le tampon de pH 9,21, cliquez sur Ajouter un point lorsque le signal est stable à environ 83 millivolts. Vérifiez que les microélectrodes répondent linéairement entre pH 4,01 et 9,21 pour une courbe d’étalonnage en deux points. Posez soigneusement le boîtier de protection à plat sur le banc et retirez-le d’un mouvement rapide et rapide pour retirer la microélectrode.
Montez la microélectrode sur un micromanipulateur et disposez le stéréoscope et le micromanipulateur de manière à ce que la microélectrode puisse avancer librement vers la boîte de culture. Positionnez la boîte de culture contenant les organoïdes pour le profilage. Fixez légèrement l’électrode de référence à la pince du support annulaire à gauche du stéréoscope.
Avancez visuellement l’extrémité de la microélectrode jusqu’à ce qu’elle soit suffisamment immergée dans le support. Une fois le signal stabilisé, enregistrez trois lectures de pH du support. Ensuite, faites avancer lentement la microélectrode dans l’ECM sans toucher les organoïdes.
Enregistrez au moins trois lectures de pH pour calculer la moyenne. Positionnez la microélectrode le long de l’axe perpendiculaire à la surface de l’organoïde, en faisant doucement une petite indentation sur la surface de l’organoïde basolatéral sans la pénétrer. Avancez délicatement la microélectrode dans l’organoïde et mesurez le pH luminal.
Une fois terminé, procédez à la mesure du pH de l’organoïde suivant. Replacez l’électrode à nettoyer dans son tube de protection. Rincez l’électrode en série avec de l’eau déminéralisée, de l’éthanol et un tampon.
Placez l’électrode de référence dans un bécher rempli d’une solution de chlorure de potassium à trois molaires. Remplissez un capillaire en verre de deux microlitres avec de l’huile minérale stérile et chargez-le sur un auto-injecteur de nanolitres contrôlé par un micromanipulateur. Enfin, remplissez-le d’une solution contenant 0,02% de rouge de méthyle et 150 millimolaires d’acide chlorhydrique et effectuez l’injection avec 9,2 nanolitres de la solution.
La variation du pH luminal sur 10 organoïdes sur la même plaque de culture était minime, avec des mesures constamment autour de 8,16. Le pH intraluminal de cinq lignées d’organoïdes différentes était constant dans chaque culture, mais une variabilité significative a été observée entre les lignées d’organoïdes. Le pH luminal organoïde était constamment inférieur à celui des ECM, qui à leur tour étaient inférieurs au pH du milieu, ce qui suggère que le pH luminal est physiologiquement pertinent et qu’il n’est pas uniquement déterminé par l’environnement de culture environnant.
L’injection de rouge de méthyle dans la lumière organoïde a confirmé qu’il avait un pH supérieur à 6,2, ce qui correspond aux mesures des microélectrodes qui ont montré un pH presque neutre.
