Notre protocole mesure l’ATP, un transmetteur important dans la vessie, ce qui nous permettra d’interroger davantage les mécanismes contrôlant sa libération. Notre technique mesure l’ATP directement à partir de la lumière de la vessie, ce qui la rend plus pertinente physiologiquement que les techniques utilisant des cellules en culture ou du tissu vésical. Keara Healy et Stephanie Daugherty, techniciennes de recherche dans mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.
Pour commencer, induisez une anesthésie initiale en plaçant l’animal dans une boîte fermée gazée avec 4% à 5% d’isoflurane dans de l’oxygène. Administrer de l’uréthane par voie sous-cutanée bilatéralement, puis placer l’animal dans une cage pour permettre à l’uréthane de faire effet pendant près de deux heures. Après avoir attendu que l’uréthane fasse effet, testez un plan d’anesthésie approprié en pinçant le pied de l’animal à l’aide d’une pince.
Pour éviter la contraction de la vessie en réponse à la distension pendant l’expérience, injectez à l’animal un agent bloquant ganglionnaire, l’hexaméthonium. Ensuite, appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux de l’animal pour éviter le dessèchement pendant l’expérience. Maintenant, rasez l’abdomen de l’animal et effectuez une laparotomie médiane pour exposer la vessie.
À l’aide d’une flamme, évaser une extrémité d’une courte longueur de tube intramédical PE50, placer une aiguille de calibre 22 dans l’autre extrémité du tube et la remplir de solution Krebs. Placez une petite boucle de suture de soie 3-0 sur le dôme de la vessie et effectuez une petite cystostomie pour insérer l’extrémité évasée du cathéter. Tout en tenant le cathéter d’une main, serrez la boucle de suture pour fixer le cathéter en place avec l’autre main.
Terminez la fixation du cathéter en attachant deux nœuds dans la suture. Tirez le cathéter vers l’arrière jusqu’à ce que la tête évasée soit en contact avec la paroi de la vessie. Testez la configuration pour détecter les fuites en perfusant une petite quantité de solution de Krebs à travers le cathéter.
Trempez l’extrémité d’un cathéter IV dans un lubrifiant chirurgical. Tenez doucement le méat urétral externe avec une paire de pinces et insérez l’extrémité du cathéter dans l’orifice urétral dans la direction de la queue, comme décrit dans le manuscrit. Faites pivoter le cathéter de 90 degrés et avancez doucement.
Insérez le cathéter jusqu’à ce que le moyeu de verrouillage luer soit à cinq millimètres distal de l’ouverture urétrale externe. Fixez le cathéter et évitez les fuites autour du cathéter en bouclant une courte longueur de suture de soie 3-0 autour du méat urétral externe et en l’attachant fermement. Fixez le cathéter à la queue avec du ruban adhésif pour éviter qu’il ne soit accidentellement retiré.
Une fois le cathétérisme effectué, infuser doucement la solution de Krebs dans la vessie à travers le cathéter vésical sus-pubien et confirmer que le liquide s’écoule hors du cathéter urétral et non autour de celui-ci. Fermez l’incision abdominale sur la vessie à l’aide d’une suture en soie 3-0. Placez un sous-tampon absorbant sur un coussin chauffant pour maintenir la chaleur corporelle et absorber le liquide.
Fixez l’animal sur la planche inclinée pour aider à drainer le liquide intravésical à travers le cathéter urétral, puis allumez le coussin chauffant. Connectez le cathéter sus-pubien à un robinet d’arrêt à trois voies reliant le cathéter à une pompe à seringue et à un transducteur de pression. Connectez le transducteur de pression à un ordinateur via un amplificateur et un système d’acquisition de données.
Infuser la solution de Krebs à travers le cathéter sus-pubien à un débit de 0,1 millilitre par minute et laisser le liquide s’écouler à travers le cathéter urétral pendant une heure pour éliminer tout résidu d’ATP libéré lors des implantations du cathéter. Après cette période de lavage, boucher le cathéter urétral à l’aide d’un bouchon de verrouillage luer. Mesurez la pression dans la vessie et recherchez une augmentation lente de la pression intravésicale à une pression de 30 centimètres d’eau sans une forte augmentation de la pression, indiquant une contraction de la vessie.
Retirez le bouchon du cathéter urétral lorsque la pression atteint 30 centimètres d’eau pour éviter d’endommager la vessie. Infuser la vessie et recueillir l’éluant du cathéter urétral. Tester immédiatement 100 microlitres aliquotes de l’éluant pour l’ATP ou congeler pour une quantification ultérieure du lot.
Pour tester l’effet de la distension de la vessie sur les concentrations luminales d’ATP, boucher le cathéter urétral avec le bouchon et surveiller la pression de la vessie jusqu’à ce qu’elle atteigne le niveau souhaité, puis déboucher le cathéter urétral et recueillir l’éluant pour la mesure ou la congélation de l’ATP, comme décrit ci-dessus. Après chaque distension, laissez la vessie se reposer et se laver pendant 10 à 15 minutes avant de prélever des échantillons supplémentaires. Pour tester l’effet des médicaments sur la libération d’ATP, remplacer la solution de Krebs par injection de la vessie par Krebs contenant le médicament de votre choix.
Perfuser le médicament pendant 10 à 15 minutes pour avoir un effet, puis prélever les échantillons des vessies non distendues et distendues, comme démontré précédemment. Placez 100 microlitres d’échantillon de perfusat avec 50 microlitres du mélange de dosage dans le luminomètre pour la lecture. Pour convertir les unités légères relatives en concentration d’ATP, effectuer des dilutions en série d’ATP dans une solution de Krebs allant d’une micromolaire à 10 picomolaires dans des dilutions décuplées pour créer une courbe standard, et les lire dans le luminomètre.
Tracer les lectures résultantes sur un graphique et effectuer une régression non linéaire pour extrapoler les concentrations à partir des échantillons prélevés sur l’animal. La perfusion de la solution dans la vessie alors que le cathéter urétral est bouché provoque une forte augmentation de la pression intravésicale à mesure que la vessie se contracte. Après l’administration d’hexaméthonium, une augmentation plus progressive de la pression intravésicale a été observée, permettant à la pression d’augmenter jusqu’à 30 centimètres d’eau sans contraction.
Le bleu brillant FCF diminue considérablement la pente de la courbe standard, suffisamment pour modifier les valeurs calculées pour la concentration d’ATP dans l’échantillon. Le calcul de la concentration d’ATP dans un échantillon à l’aide de l’étalon de Krebs contenant du bleu brillant FCF peut entraîner une sous-estimation de la concentration d’ATP de 50%La distension de la vessie augmente les concentrations luminales d’ATP, qui peuvent être diminuées en présence de NTPDase apvrase, ou augmentées lorsque les ECA NTPD endogènes sont inhibées par ARL67156. La libération d’ATP induite par l’étirement de l’urothélium a été analysée.
La libération d’ATP évoquée par distension est bloquée par les antagonistes du canal panectine, le bleu brillant FCF et la carbonoxolone, mais pas par un antagoniste du canal connexon, l’acide alpha-glycyrrhétinique. Il est impératif que toutes les lectures du luminomètre soient converties en concentrations d’ATP en utilisant la courbe standard appropriée, car la réaction Lucifer Luciferase est très sensible aux interférences d’une grande variété d’agents différents. Notre technique pourrait être utilisée pour étudier la libération évoquée par distension de toute molécule dans la lumière de la vessie, en supposant qu’il existe un dosage approprié pour cette molécule.
