Ce protocole permet une visualisation des structures tridimensionnelles en rein complet, ce qui peut mener à des découvertes innovantes dans la recherche rénale en fournissant une perspective macroscopique. La coloration des organes entiers est difficile en raison de la difficulté de pénétration des anticorps. Ce protocole a démontré la coloration complète de haute qualité des reins par les anticorps.
Pour commencer, effectuez la fixation par immersion immédiatement après la fixation de perfusion et le prélèvement rénal, en immergeant le rein dans du paraformaldéhyde à 4% à quatre degrés Celsius pendant 16 heures. Donnez trois lavages en utilisant PBS pendant deux heures chacun. Effectuer le processus de décoloration et de délipidation en immergeant le rein fixe dans sept millimètres de 50% CUBIC-L dans un tube à fond rond de 14 millilitres, en agitant doucement à température ambiante.
Après six heures, plongez le rein dans sept millilitres de CUBIC-L dans un tube à fond rond de 14 millimètres, en agitant doucement à 37 degrés Celsius pendant cinq jours. Actualisez CUBIC-L tous les jours. Une fois la décoloration et la délipidation terminées, utilisez une cuillère de distribution pour la manipulation de l’échantillon et lavez le rein trois fois avec du PBS à température ambiante pendant deux heures.
Immunocolorer le rein délipidé dans des anticorps primaires dilués dans une solution tampon de coloration, avec agitation douce dans un agitateur incubateur à 37 degrés Celsius pendant sept jours. Ensuite, lavez le rein avec 0,5% Triton X-100 dans PBS, également connu sous le nom de PBST, à température ambiante pendant une journée. Pour la coloration des anticorps secondaires, traiter le rein avec des anticorps secondaires dans le tampon de coloration, dans l’obscurité, avec une légère agitation à 37 degrés Celsius pendant sept jours.
Fixez la coloration avec un lavage PBST à température ambiante pendant une journée. Après la fixation, immergez le rein dans du formaldéhyde à 1% dans du PB pendant trois heures et lavez-le avec du PBS à température ambiante pendant six heures. Effectuez l’appariement de l’indice de réfraction en immergeant le rein dans sept millilitres de 50% CUBIC-R+ dans un tube à fond rond de 14 millilitres avec agitation pendant une journée, suivi d’un traitement avec sept millilitres de CUBIC-R+ avec agitation à température ambiante pendant deux jours.
Avec l’aide de la méthode de coloration immunitaire, les nerfs sympathiques et les artères d’un rein entier ont été visualisés en imagerie rénale 3D. De plus, des nerfs sympathiques rénaux anormaux ont été visualisés après une lésion d’ischémie-reperfusion. Ce protocole a également facilité la visualisation des nerfs sympathiques dans toute la rate.
Le processus de quantification des données pour la coloration immunofluorescente tridimensionnelle est présenté ici. De plus, les canaux collecteurs, le segment S1 des tubules proximaux et les glomérules ont été visualisés avec succès dans un rein entier. La glomérulomégalie supprimée, résultant de l’administration de médicaments dans les premiers stades de la maladie rénale diabétique, a également été visualisée en imagerie 3D.
Ce protocole peut marquer la molécule spécifique dans un rein entier. Ainsi, les chercheurs peuvent analyser l’altération de la structure dans le système vasculaire ou trouver des événements rares dans les tissus rénaux.
