Collecte de matrice sous-endothéliale à partir de cultures de cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes (REC) pour la mesure de la rigidité au microscope à force atomique (AFM)

Pour commencer, rincez environ cinq fois sur un agitateur orbital des lamelles enrobées de gélatine réticulée au glutaraldéhyde dans du PBS contenant du calcium et du magnésium. Lors des trois premiers rinçages, soulevez les lamelles à l’aide d’une pince à épiler stérile pour permettre un rinçage complet du glutaraldéhyde. Ensuite, remplacez le milieu de culture des CER de souris par un milieu frais complété par de l’acide ascorbique stérile et filtré.

Après 15 jours de traitement, rincez les cellules avec du PBS sans calcium et magnésium. Incuber les cellules dans 250 microlitres de tampon de décellularisation chaud pendant deux à trois minutes. Confirmez la décellularisation des cellules à l’aide d’un microscope à contraste de phase.

Pipetez doucement le tampon sans perturber la matrice sous-endothéliale sécrétée par REC. Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de PBS dans chaque puits. Après avoir retiré le PBS, ajoutez 200 microlitres de DNase libre RNase.

Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour éliminer tous les débris cellulaires. Ensuite, visualisez la matrice sous-endothéliale fibreuse à l’échelle macroscopique sous un microscope à contraste de phase. Ensuite, utilisez un microscope confocal pour visualiser les fibres matricielles nanométriques plus fines à un grossissement de 100x.

Des agrégats de matrice sous-endothéliale ont été observés sur les lamelles de verre après la décellularisation de cultures de 10 ou 15 jours de CER humaines ou de souris. La microscopie confocale des matrices décellularisées a montré une matrice nanofibrillaire dense de collagène-IV et de fibronectine.