Pour commencer, effectuez une réaction en chaîne par polymérase, ou PCR, pour amplifier la région souhaitée de l’ADN extrait du tissu. Amenez le mélange principal d’enzymes d’amplification de séquençage, le tampon et l’eau distillée à température ambiante et essorez-le instantanément. Après avoir préparé les tubes pour le séquençage, placez le tube PCR sur l’instrument PCR prédéfini pour l’amplification.
Retirez ensuite le produit de l’instrument PCR et conservez les produits de réaction au réfrigérateur, à l’abri de la lumière. Vortex les perles magnétiques à fond. Ajoutez 10 microlitres de billes magnétiques et 40 microlitres d’éthanol à 80 % dans la plaque de 96 puits et scellez la plaque avec un film.
Placez la plaque à 96 puits sur un agitateur vortex pendant 10 secondes pour suspendre complètement et mélanger les billes. Fixez ensuite la plaque à l’aide d’un élastique sur un oscillateur horizontal et vibrez au réglage maximum pendant trois à cinq minutes. Ensuite, placez la plaque PCR sur un support magnétique, en vous assurant qu’elle est fermement enfoncée.
Maintenez le support à quatre degrés Celsius pendant trois minutes pour l’adsorption statique. Une fois les billes adsorbées, retirez le film de plafond et versez les déchets liquides. Rincez les billes deux fois avec 40 microlitres d’éthanol à 80%.
Après avoir versé les déchets liquides, placez la plaque sur du papier absorbant et séchez-la doucement. Placez le papier absorbant avec la plaque magnétique dans une centrifugeuse et essorez brièvement à 120 g. Après avoir retiré l’alcool, placez la plaque dans un four à 60 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes pour sécher complètement les billes.
Ensuite, ajoutez 40 microlitres d’eau pure dans la plaque et scellez-la avec un film. Secouez-le sur un agitateur vortex pendant trois à cinq secondes et placez l’assiette sur un agitateur horizontal. Fixez-le et laissez la plaque agiter pendant trois à cinq minutes pour dissoudre le produit de séquençage purifié.
Enfin, faites tourner le produit de séquençage dissous à 180 g et utilisez le produit pour l’analyse génomique par électrophorèse capillaire. Cette méthode pourrait détecter la mutation connue RHOA G17V et d’autres mutations à basse fréquence dans l’intervalle d’amplification des amorces en amont et en aval. Les mutations de deux gènes supplémentaires, à savoir IDH2 et JAK1, ont également été correctement analysées à l’aide de cette méthode.
