Le séquençage nanopore de troisième génération est une nouvelle technologie puissante de séquençage qui permet d’obtenir très facilement des informations sur la séquence à partir d’une grande variété d’échantillons. Les principaux avantages de cette technique sont la portabilité du dispositif de séquençage, la longueur de lecture extrêmement longue et la disponibilité en temps réel des données. Le séquençage nanopore est une technologie particulièrement utile lors d’éclosions de maladies dans des endroits éloignés.
Il a été utilisé avec succès dans des laboratoires sur le terrain pendant et après les flambées du virus Ebola en Afrique de l’Ouest et centrale. Par le séquençage nanospore et l’utilisation du dispositif MinION à cette fin est assez facile, le soin doit être pris pendant la préparation de la bibliothèque et pendant le chargement des cellules d’écoulement. Pour commencer cette procédure, configurer un PCR touchdown pour amplifier l’ADN avec amorce réglé un en utilisant un démarrage à chaud polymésase d’ADN haute fidélité avec le tampon de réaction approprié dans un volume de réaction de 50 microlitres avec un modèle de microlitres.
Si possible, installez la réaction sur la glace ou dans un bloc de refroidissement à quatre degrés Celsius. Incuber la réaction dans un thermocycleur tel que décrit dans le protocole de texte. Après cela, transférez 50 microlitres du produit PCR dans un tube de réaction à faible liaison d’ADN de 1,5 millilitre.
Resuspendez soigneusement les perles magnétiques par vortex. Ajouter ensuite 50 microlitres de perles à la réaction PCR et bien mélanger. Incuber l’échantillon sur un mélangeur rotatif pendant cinq minutes à température ambiante tout en tournant à 15 RPM.
Tournez brièvement vers le bas de l’échantillon, puis placez le tube sur une grille magnétique pour granuler les perles magnétiques. Attendez que le surnatant ait été complètement clarifié avant de continuer. Ensuite, aspirez le supernatant sans déranger la pastille de perle et jetez-la.
Pipette 200 microlitres de 70% d’éthanol dans le tube de réaction et incuber pendant 30 secondes à température ambiante. Aspirez l’éthanol sans déranger la pastille de perle et jetez-la. Répétez ce processus de lavage avec de l’éthanol une fois de plus pour un total de deux lavages.
Sécher à l’air le granulé pendant une minute à température ambiante. Retirez ensuite le tube de réaction de la grille magnétique. Resuspendez la pastille dans 30 microlitres d’eau sans nucléase et incubez à température ambiante pendant deux minutes.
Remettre le tube de réaction sur la grille magnétique et attendre que les perles de réaction soient complètement granulées. Après cela, retirez le surnatant sans déranger la pastille et transférez-le dans un nouveau tube de réaction de 1,5 millilitre. Si plusieurs échantillons doivent être séquencés en même temps, les codes à barres peuvent maintenant être ajoutés par deux étapes pcr supplémentaires suivies d’un nettoyage de l’ADN comme indiqué précédemment.
Tout d’abord, combiner une quantité égale d’ADN codé à barres de chaque échantillon pour un total d’un microgramme d’ADN dans un volume de 45 microlitres dans un tube de réaction de 0,2 millilitre. Pour le dA-Tailing, ajouter sept microlitres de tampon de réaction de préparation d’extrémité, trois microlitres du mélange d’enzymes de préparation d’extrémité, et cinq microlitres d’eau libre de nucléase. Feuilleter doucement le tube pour mélanger.
Dans un thermocycler, incuber la réaction pendant cinq minutes à 20 degrés Celsius suivie de cinq minutes à 65 degrés Celsius. Ensuite, effectuez la purification PCR du produit de réaction tel que décrit dans le protocole de texte. En option, prenez un microlitre pour quantifier la concentration de l’échantillon à l’aide d’un spectrophotomètre UV.
Combinez 22,5 microlitres de l’ADN purifié précédemment obtenu avec 2,5 microlitres d’adaptateur 1D2 et 25 microlitres de Blunt/TA Ligase Master Mix dans un nouveau tube de réaction à faible liaison ADN de 1,5 millilitre. Feuilleter doucement le tube pour mélanger. Faire tourner brièvement le mélange et incuber à température ambiante pendant 10 minutes.
Effectuez ensuite la purification PCR du produit de réaction tel qu’il est décrit dans le protocole texte. Combinez 45 microlitres du produit de réaction avec cinq microlitres de mélange adaptateur de code à barres et 50 microlitres de Blunt / TA Ligase Master Mix dans un tube de réaction à faible liaison ADN. Feuilleter doucement pour mélanger et incuber pendant 10 minutes à température ambiante.
Purifier le produit de réaction tel que décrit dans le protocole textuel et conserver le produit résultant sur la glace ou à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi. Pour commencer, effectuez un contrôle de qualité sur la cellule d’écoulement avant utilisation. À cette fin, connectez le dispositif de séquençage à l’ordinateur hôte et ouvrez le logiciel.
Insérez une cellule d’écoulement dans le dispositif de séquençage. Choisissez ensuite le type de cellule d’écoulement de la boîte de sélecteur et cliquez sur disponible pour confirmer. Au bas de l’écran, cliquez sur vérifiez la cellule d’écoulement et choisissez le bon type de cellule d’écoulement.
Cliquez sur démarrer le test pour commencer le contrôle de qualité. Au total, un minimum de 800 nanopores actives est nécessaire pour que la cellule d’écoulement soit utilisable. Tout d’abord, ouvrez le couvercle du port d’amorçage en le glissant dans le sens des aiguilles d’une montre.
Réglez une pipette P1000 à 200 microlitres et insérez la pointe dans le port d’amorçage. Réglez ensuite la pipette à 230 microlitres tout en gardant la pointe dans le port d’amorçage pour dessiner 20 à 30 microlitres de tampon et enlever toutes les bulles d’air. Dans un nouveau tube de réaction à faible liaison adn de 1,5 millilitre, préparez le mélange d’amorçage en combinant 576 microlitres de tampon RBF avec 624 microlitres d’eau sans nucléase.
Pipette soigneusement 800 microlitres du mélange d’amorçage préparé dans le port d’amorçage et attendre cinq minutes. Après cela, soulevez le couvercle du port d’échantillonnage et pipette 200 microlitres supplémentaires du mélange d’amorçage préparé dans le port d’amorçage. Pipette 35 microlitres du tampon RBF dans un nouveau tube de réaction propre de 1,5 millilitre d’ADN à faible liaison.
Bien mélanger les perles LLB par pipetting et ajouter 25,5 microlitres des perles au tampon RBF. Ensuite, ajoutez 2,5 microlitres d’eau sans nucléase et 12 microlitres de bibliothèque d’ADN et mélangez par pipetting. Ajouter 75 microlitres du mélange de l’échantillon d’une manière lente goutte sage à la cellule d’écoulement via le port échantillon.
Remplacez ensuite le couvercle du port échantillonné, fermez le port d’amorçage et fermez le couvercle du dispositif de séquençage. Dans le logiciel, confirmez que la cellule d’écoulement est toujours disponible. Ouvrez une nouvelle expérience et configurez les paramètres d’exécuteur en sélectionnant le kit utilisé.
Sélectionnez basecalling en direct. Démarrer l’exécuter de séquençage en cliquant sur commencer l’expérience. Poursuivre la course au séquençage jusqu’à ce que suffisamment de données expérimentales soient recueillies.
Dans une expérience représentative, l’ARN est extrait de 10 échantillons de sang différents de cinq espèces animales. Des concentrations d’ARN sont observées entre 43 nanogrammes et 543 nanogrammes par microlitre. Après amplification par RT-PCR, l’analyse de gel des produits PCR MPC1 montre divers résultats avec des bandes nettement plus faibles pour les échantillons BC01 et BC02.
Ces différences sont très probablement causées par des différences dans la qualité de l’échantillon, bien que des différences dans l’efficacité de la PCR dues à des différences dans l’amorce se liant au gène MCP1 de différentes espèces ne puissent être exclues. Toutefois, ces différences de rendement et/ou d’efficacité de l’amplification n’ont pas d’incidence marquée sur le résultat global du séquençage. Un sous-ensemble de 10 000 lectures obtenues est ensuite sélectionné et décousu pour une analyse plus approfondie.
Sur les 10 000 lires analysées, 5 457 montrent une longueur comprise entre 1 750 et 2 000 nucléotides qui correspond aux tailles prévues pour les fragments pcr amplifiés dans le cadre de notre flux de travail. Un pic supplémentaire dans la distribution de la longueur des lues est observé entre 250 et 500 nucléotides qui peuvent être attribués à des produits PCR non spécifiques. Le démultiplexage des lectures permet d’assigner 87,6 % des lues à l’un des 10 échantillons analysés.
Bien que cette méthode soit assez fiable, dans des conditions de champ, l’amplification PCR est l’étape la plus problématique. Au cours de nos expériences, des protocoles imbriqués étaient souvent nécessaires pour amplifier les séquences cibles. Outre le séquençage des gènes de l’hôte animal, cette méthode peut également être utilisée pour séquencer tout ADN ou ARN, y compris les pathogènes viraux ou bactériens.
Le séquençage nanopore est donc de plus en plus utilisé non seulement lors d’épidémies ou d’études scientifiques dans des endroits éloignés, mais aussi dans des laboratoires réguliers où les longues longueurs de lecture ouvrent de nouvelles possibilités de recherche intéressantes. Bien qu’aucun des reagents utilisés ne soit particulièrement dangereux, les bonnes pratiques de laboratoire standard devraient être suivies. Évidemment, lors du séquençage des agents de la maladie, toutes les précautions nécessaires pour manipuler ces agents doivent être observées.
