Pour commencer, placez les réactifs nécessaires à la préparation de l’électrophorèse sur gel sur une plate-forme de travail. Ajoutez du Tris/Borate/EDTA, ou TBE, à de l’agarose et chauffez la solution au micro-ondes. Ensuite, versez l’agarose à 0,4-0,5 % dans un plateau de coulée pour préparer un gel d’agarose de première dimension et laissez-le se solidifier pendant une heure.
Après solidification, chargez l’échelle dans les 3 premiers centimètres par rapport au bord le plus à gauche du gel. Chargez ensuite les échantillons d’ADN digérés avec des enzymes de restriction, en assurant une distance de 3 centimètres entre chaque paire. Faites fonctionner le gel dans TBE pendant 19 à 24 heures à 0,85 volt par centimètre pour séparer les intermédiaires par taille.
Le lendemain, retirez le gel du tampon. Excise les 3 premiers centimètres du gel contenant l’échelle. Colorer le segment de gel dans l’encéphalite à tiques contenant 0,3 microgramme par millilitre de bromure d’éthidium pendant 10 à 15 minutes.
Visualisez ensuite l’échelle à l’aide d’un système de documentation en gel. Sur le gel d’agarose, ajoutez 1,3 centimètre à l’emplacement estimé, ce qui donne une valeur de A.Soustrayez ensuite 7,5 centimètres de la valeur A, ce qui donne la valeur B.Alignez la règle contre le gel de première dimension et coupez horizontalement aux valeurs A et B.Coupez ensuite verticalement l’espace de 3 centimètres réservé à chaque échantillon. Dans un nouveau plateau de coulée, tournez les segments dans le sens des aiguilles d’une montre et placez-les dans la position des puits d’échantillon.
Préparez le gel d’agarose de deuxième dimension à une concentration de 1 à 1,3 % dans de l’encéphalite à éthylène avec 0,3 microgramme par millilitre de bromure d’éthidium. Chauffez le gel et, une fois refroidi à environ 55 degrés Celsius, versez-le sur les segments de première dimension tournés. Laissez le gel se solidifier pendant une heure.
Après solidification, transférez le gel dans une chambre contenant du TBE à 0,3 microgramme par millilitre de bromure d’éthidium et laissez-le s’équilibrer pendant 30 minutes. Couvrez le gel et faites-le fonctionner pendant 9 à 10 heures à 4,23 volts par centimètre à 4 degrés Celsius. Retirez le gel de deuxième dimension de la chambre et dépurinez les fragments d’ADN pendant 10 minutes dans une solution d’acide chlorhydrique 0,24 molaire avec un léger balancement.
Rincez le gel à l’eau déminéralisée et faites-le tremper dans de l’hydroxyde de sodium 0,4 molaire pendant 10 à 15 minutes. Pliez ensuite deux longues feuilles de papier de chromatographie perpendiculairement à la feuille de verre, en prolongeant dans le récipient. Pour assembler le transfert sud, remplissez un récipient avec 1 litre d’hydroxyde de sodium de 0,4 molaire.
Alignez une longue feuille de verre sur le récipient. Mouillez le haut du papier avec de l’hydroxyde de sodium et retirez soigneusement toutes les bulles d’air sous sa surface. Trempez trois feuilles de papier de chromatographie avec de l’hydroxyde de sodium et placez-les sur le papier de la chemise.
Retirez toutes les bulles d’air. Retournez le gel de deuxième dimension et placez-le sur les papiers de chromatographie. Mouillez une membrane en nylon chargée positivement avec de l’eau déminéralisée et placez-la sur le gel.
Placez ensuite trois feuilles de chromatographie mouillées d’eau déminéralisée sur la membrane. Couvrez tout hydroxyde de sodium exposé dans le récipient avec une pellicule plastique pour éviter l’évaporation. Placez une pile de serviettes ou d’essuie-tout de 0,3 à 0,5 mètre de haut sur la tache.
Comprimez tout le transfert avec un poids pour faciliter l’action capillaire serrée et laissez-le pendant deux jours pour le transfert de l’ADN vers la membrane.
