Pour commencer, placez un tube de 50 millilitres sur de la glace et ajoutez du collagène dans une solution ainsi que d’autres composants séquentiellement. Secouez le tube pour bien mélanger. À l’aide d’une pipette P10, ajoutez une solution molaire d’hydroxyde de sodium goutte à goutte tout en agitant la solution de mélange pour ajuster le pH à 7,3.
Ajoutez 1,25 millilitre de matrice de membrane basale au mélange de cinq millilitres de collagène et mélangez doucement la solution. Ensuite, placez une assiette à 12 puits sur de la glace pendant deux minutes. À l’aide d’embouts à alésage large, ajoutez lentement le mélange de matrice de collagène à une membrane basale dans la plaque à 12 puits.
Placez la plaque de 12 puits dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant deux heures pour solidifier la première couche d’hydrogel. Conservez le reste du mélange de matrice de collagène sur de la glace pour une utilisation ultérieure. Transférez ensuite environ 60 agrégats de cellules dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.
Et refroidissez le tube sur de la glace pendant cinq minutes. À l’aide d’une pointe de pipette P200, retirez délicatement le fluide du tube. Ajoutez 1,5 millilitre du mélange de collagène à une membrane basale, goutte à goutte aux agrégats cellulaires, et mélangez-les doucement à l’aide d’une pointe de pipette P200 à large alésage pour les remettre en suspension.
Transférez la plaque avec la première couche d’hydrogel de l’incubateur dans l’enceinte de biosécurité. Ajoutez 1,5 millilitre de suspension d’agrégats sur la couche d’hydrogel durci et secouez doucement la plaque pour répartir uniformément les agrégats. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant deux heures.
Différenciation vasculaire préchauffée deux fois dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ajoutez deux millilitres de milieu dans chaque puits et cultivez les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Changez le milieu tous les trois jours avec le milieu de différenciation vasculaire frais préchauffé deux.
Les organoïdes exprimaient CD31, ERG1 et PDGFR bêta, indiquant la présence de cellules endothéliales vasculaires et de parasites. Les réseaux vasculaires ont été visualisés par microscopie d’immunofluorescence à monture entière après clarification des tissus. Les organoïdes matures colorés au jour 17 ont montré des réseaux vasculaires encapsulant les sphéroïdes dans le bloc de gel.
Les organoïdes récupérés le jour 28 avaient des réseaux vasculaires qui s’enroulaient autour des sphéroïdes au lieu de s’étendre radialement.
