Cette méthode peut être réalisée dans n’importe quel laboratoire équipé pour des expériences de culture cellulaire. En utilisant cette méthode, nous pouvons approfondir notre compréhension du développement rénal et des voies de la maladie. Il s’agit d’une méthode relativement simple et peu coûteuse par rapport à d’autres pour générer des organoïdes rénaux.
Le plus grand défi de cette technique est de maintenir une culture de cellules souches pluripotentes humaines de haute qualité. Il est essentiel que les cellules soient maintenues à moins de 80% de confluence et se divisent régulièrement. Les chercheurs novices en culture de cellules souches pluripotentes chez l’homme devraient se familiariser avec les lignées de cellules souches avant de procéder à la différenciation.
Commencez le test organoïde rénal en ajoutant deux millilitres de milieu E5-ILP complet dans chaque puits d’une plaque de fixation ultra-basse de six puits. Cultiver des cellules souches pluripotentes humaines, ou CSEh, dans des plaques de culture tissulaire de 100 millimètres jusqu’à ce qu’elles atteignent 60% de confluence. Lavez les CSEh deux fois avec environ huit millilitres de DPBS.
Aspirer le DPBS, puis ajouter deux millilitres de Dispase goutte à goutte pour couvrir les cellules, et les incuber pendant six minutes à 37 degrés Celsius. Lavez les cellules trois fois avec environ 10 millilitres de DPBS. Aspirez le DPBS, puis inclinez la plaque de 45 degrés et grattez les cellules avec un élévateur de cellules.
Laver les colonies par le haut avec six millilitres de milieu E5-ILP complet à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres. Ensuite, en tenant la pipette verticalement, brisez les grandes colonies en pipetant doucement de haut en bas, en prenant soin de ne pas toucher les côtés de la plaque de culture. Répartissez les grappes de colonies uniformément en ajoutant un millilitre par puits dans la plaque à six puits, puis placez la plaque sur un agitateur orbital à l’intérieur d’un incubateur de 37 degrés Celsius.
Alternativement, si un agitateur orbital n’est pas disponible, les cellules peuvent être cultivées statiquement. Le deuxième jour, après avoir laissé les corps embryoïdes se déposer au bas de la plaque, inclinez la plaque de 45 degrés et aspirez lentement le milieu par le haut, en laissant un millilitre par puits. Ajouter deux millilitres de milieu complet préparé par puits et remettre la plaque à l’agitateur.
Le troisième jour, après avoir aspiré le milieu comme démontré précédemment, prélever soigneusement tous les corps embryoïdes de chaque puits à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres et les transférer dans un tube conique de 50 millilitres. Pour recueillir les corps embryoïdes restants, rincez chaque puits avec un millilitre de DMEM à faible teneur en glucose et ajoutez-les dans le même tube conique de 50 millilitres. En attendant que les corps imbroïdes se déposent au fond du tube, ajoutez deux millilitres de milieu de stade II à chaque puits de la plaque à six puits.
Ensuite, tamisez les gros corps embryoïques en plaçant une passoire cellulaire de 200 micromètres sur un nouveau tube conique de 50 millilitres et en pipetant soigneusement tous les corps embryonnaires sur la passoire cellulaire. Rincez la passoire cellulaire avec cinq millilitres supplémentaires de DMEM pour recueillir tous les corps embryoïdes coincés dans la passoire. Aux stades ultérieurs, utilisez d’abord une passoire de 500 micromètres pour tamiser de très gros corps embryonnaires, puis passez le filtrat à travers une passoire de 200 micromètres pour tamiser de très petits corps embryoïdes sans tubules.
Collectez les corps d’embryides de taille correcte, entre 200 et 500 micromètres, en inversant la passoire de 200 micromètres dans un nouveau tube de 50 millilitres et en lavant la passoire avec DPBS. Après avoir filtré, laissez les corps embryoïdes se déposer au fond du tube conique, puis aspirez le surnageant et lavez avec environ 10 millilitres de DMEM. Ensuite, ressuspendez les corps embryoïdes dans six millilitres de milieu de stade II.
Transférez les corps embryoïdes dans la plaque d’attachement ultra-basse à six puits, en les répartissant uniformément entre les puits. Étant donné que la plupart des organoïdes s’accumulent au sommet de la pipette, laissez environ un demi-millilitre à la fin, puis touchez doucement la pointe au milieu dans chaque puits, permettant aux organoïdes de s’écouler dans le puits. Transférer les corps d’embryides dans une fiole de 125 millilitres avec 45 millilitres de milieu de stade II.
Réglez la vitesse d’agitation magnétique à 120 tr/min et placez la fiole dans l’incubateur. Pour nourrir les corps embryoïdes ou les organoïdes rénaux, laissez-les s’installer brièvement au fond de la fiole de spinner, puis soulevez le couvercle d’un bras latéral de la fiole et placez la pipette d’aspiration à l’intérieur avec la pointe touchant la paroi intérieure opposée. Inclinez lentement la pipette vers le bas et aspirez environ la moitié du milieu.
Reconstituez-le avec 20 millilitres de milieu frais de stade II en le pipetant à travers la même ouverture. Utilisez de longues pinces stériles pour placer soigneusement une barre d’agitation magnétique dans chaque puits d’une plaque de six puits avec des corps embryoïdes ou des organoïdes rénaux. Placez la plaque sur la plaque d’agitation magnétique à six roues et réglez la vitesse à 120 tr / min.
Pour que les barres d’agitation magnétiques s’enclenchent et commencent à tourner, réglez d’abord le niveau de puissance à 100. Une fois que toutes les barres commencent à tourner, ramenez le niveau de puissance à 25. Maintenir les organoïdes rénaux en changeant la moitié du milieu comme démontré précédemment.
L’immunofluorescence des sections de paraffine des organoïdes rénaux du jour 14 montre la présence de segments de néphron tels que des tubules rénaux exprimant le facteur nucléaire hépatocytaire bêta-1 et la lectine tétragonolobus de Lotus, ainsi que des amas de podocytes exprimant le fibrosarcome musculoaponeurotique V-maf oncogène homologue B et néphrine. Les modifications apportées à ce protocole peuvent favoriser l’expansion des cellules endothéliales, comme le confirme la coloration avec la molécule d’adhésion des plaquettes et des cellules endothéliales-1 au jour 26 de la culture. Les cellules souches pluripotentes humaines doivent être traitées avec Dispase pendant la durée appropriée, puis soigneusement lavées pour éliminer toutes les traces.
Si Dispase n’est pas complètement éliminé, il peut entraîner la mort cellulaire et le regroupement des corps embryoïdes. Cette méthode nous a aidés à examiner le développement de maladies rénales congénitales, ainsi que diverses voies de lésions rénales et le potentiel d’interventions thérapeutiques in vitro.
