Ce protocole nous permet de créer une structure 3D complexe qui ressemble beaucoup au cœur humain en développement d’une manière simple et rentable, reproductible à travers les lignées cellulaires. Il se compose d’un seul protocole avec trois étapes de différenciation, qui donne naissance à tous les types de cellules du cœur, y compris les chambres et un réseau vasculaire. Cette technique nous permet de modéliser un large éventail de maladies cardiovasculaires humaines et de dépister des traitements pharmacologiques efficaces.
Grâce à la nature à haut débit de sa conception. Cette méthode est utile pour étudier le cœur humain en développement ainsi que les maladies qui lui sont couramment associées. L’un d’eux étant les malformations cardiaques congénitales.
Ce protocole nécessite des compétences de base en culture cellulaire. Nous recommandons un pipetage attentif et délicat ainsi qu’une manipulation douce des organoïdes. Commencez par créer des corps embryoïdes ou EB deux jours avant la différenciation.
Lavez les HPSC sous-confluents avec DBPS pendant au moins 10 secondes. Ensuite, aspirez le DPBS. Ajouter un millilitre d’ACUTA à température ambiante et tapoter doucement la plaque environ cinq fois par minute pendant trois à cinq minutes pour induire un détachement, tout en vérifiant au microscope.
Ajoutez ensuite un millilitre de milieu PSC et Thias Avin ou Thias pour arrêter la réaction. Pipeter le milieu de haut en bas dans le puits, deux à trois fois pour générer une suspension à cellule unique et recueillir les cellules. Ensuite, transférez la suspension à cellule unique dans un tube de centrifugeuse et faites tourner pendant cinq minutes à 300 fois G.Aspirez le surnageant et ré-dépensez les cellules dans un millilitre de milieu PSC et de Thias.
Diluer les cellules dans DPBS. Compter les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire ou d’un hémo-cystomètre et diluer les cellules dans un milieu PSC avec Thias à une concentration de 100 000 cellules par millilitre. Ajouter 100 microlitres de suspension de cellules diluées à chaque puits d’une plaque de 96 puits à fond rond ultra basse.
Centrifuger la plaque à 100 fois G pendant trois minutes et incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après 24 heures, retirez soigneusement 50 microlitres de milieu de chaque puits et ajoutez 200 portées de noyau de milieu PSC frais, chaud à 37 degrés Celsius pour un volume de 250 microlitres par puits. Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Retirez 166 microlitres ou deux tiers de milieu d’un côté de chaque puits et ajoutez 166 microlitres de RPMI 1640 contenant un supplément de B27 sans insuline, six 990211 de cheer micromolaires, 0,875 nanogramme par millilitre de protéine morphogénétique osseuse quatre et 1,5 nanogrammes par millilitre d’Activin A.Incubez pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après 24 heures, retirez 166 microlitres de milieu d’un côté de chaque puits et ajoutez 166 microlitres de RPMI 1640 frais avec un supplément de B27 sans insuline. Incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Pour induire la spécification du mésoderme cardiaque le deuxième jour, retirez 166 microlitres de milieu de chaque puits et ajoutez 166 microlitres de RPMI 1640, contenant un supplément de B27 sans insuline et trois Wnt-C59 micromolaires et poursuivez l’incubation pendant 48 heures. Le quatrième jour, retirez 166 microlitres de milieu de chaque puits et ajoutez 166 microlitres de RPMI 1640 frais avec un supplément de B27 sans insuline, puis incubez encore 48 heures. Le sixième jour, retirez 166 microlitres de milieu de chaque puits et ajoutez 166 microlitres de RPMI 1640 avec un supplément de B27.
Pour cela et tous les changements de milieu ultérieurs, utilisez un supplément de B27 avec de l’insuline, incubez pendant 24 heures supplémentaires. Le septième jour, la culture cellulaire est prête pour la différenciation pro épicardique. Retirez 166 microlitres de milieu de chaque puits et ajoutez 166 microlitres de RPMI 1640 frais contenant du supplément de B27 et trois cheer micromolaires 99021.
Ensuite, en incubant pendant une heure, après une heure, retirez la plaque de l’incubateur, retirez 166 microlitres de milieu d’un côté de chaque puits et ajoutez 166 microlitres de RPMI 1640 frais contenant du supplément de B27, continuez l’incubation pendant encore 48 heures. Répétez ce processus toutes les 48 heures jusqu’à la collecte. Les organoïdes sont prêts pour les analyses et l’expérimentation le jour 15 Pour transférer les organoïdes entiers, coupez l’extrémité d’une pipette P200, à cinq à 10 millimètres de l’ouverture d’un diamètre d’environ deux à trois millimètres.
Appuyez sur le piston de la pipette et insérez la pointe verticalement dans le puits inférieur rond avec l’organoïde. Prenez environ 100 à 200 microlitres de milieu suffisamment pour recueillir les organoïdes et les transférer à la destination cible. Avant que les EBS de différenciation n’apparaissent sous forme de masses sphériques noires, le processus de différenciation commence le jour zéro avec une activation de la voie Wnt et un ajout de facteur de croissance pendant exactement 24 heures.
En outre, l’édition de Wnt C59 le deuxième jour entraîne l’élargissement de l’organoïde d’environ 200 micromètres à un maximum d’un millimètre. Les organoïdes du cœur humain ont commencé à battre dès le sixième jour et 100% des organoïdes ont montré des battements visibles au jour 10. Les images à fort grossissement de l’organoïde du septième jour ont révélé que la plupart des cellules exprimant la main un étaient d’origine cardiomyocytaire et la main deux étaient des cellules non myosites du deuxième Heartfield, des cellules progénitrices.
Les transcriptions d’ARN pour la première main et la deuxième main ont été exprimées à partir du troisième jour dans les données de séquençage de l’ARN. Les marqueurs FHF ont été fortement exprimés pendant les jours trois et 11 tandis que le marqueur SF a été exprimé plus fortement après le jour 13. La coloration par immunofluorescence a révélé la présence de diverses lignées de type de cellules cardiaques humaines qui composent le cœur humain.
Tels que le tissu myocardique et épicardique, les cellules endocardiques, les cellules endothéliales et les fibroblastes cardiaques. Les marqueurs exprimant les lignées cellulaires ci-dessus ont également été observés dans les profils d’expression génique de l’ARN SAC. L’imagerie calcique vivante de cellules individuelles dans des organoïdes entiers a été utilisée pour mesurer la fonction électrophysiologique des organoïdes.
L’intensité de la fluorescence Fluo-4 a varié au fil du temps en raison de l’entrée de calcium hors de la cellule révélant des potentiels d’action réguliers. Les cartes thermiques montrant les intensités de calcium sur une région de grossissement élevé de l’organoïde montrent une intensité accrue due aux transitoires de calcium et aux cellules individuelles. Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit que les EB et les organoïdes suivants ne sont pas attachés au bas de la plaque, et nous nous déplacerons avec le retrait en plus des supports nécessitant des changements de support attentifs.
Les organoïdes peuvent être cultivés pendant de plus longues périodes de temps introduites dans les techniques de maturation, ou même exposés à des stimuli externes, tels que le conditionnement mécanique ou électrique, et même à des facteurs de stress tels que les toxines. Cette technique permet d’accéder à des stades du développement cardiaque fœtal humain qui sont autrement inaccessibles dans la recherche, ouvrant la voie à de nouvelles connaissances sur le développement cardiaque et l’étiologie des maladies.
