L&#39;élevage d&#39;experts fournis par Tina Martin et David Albright est grandement apprécié. Cette recherche a été financée par des subventions T32-AI-07285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059830-06 du NIH.

1. Animaux X. laevis x X. Gilli hybrides LG-6 et LG-15 clones isogenetic 1 sont de notre colonie de reproduction à l&#39;Université de Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG et LG-6-15 partagent le même haplotype CMH hétérozygote (A / C) mais diffèrent au mineur d&#39;histocompatibilité (H) loci. La descendance de ces clones sont produits par gynogenèse, dans lequel les œufs diploïdes produites par la femelle sont activés par les UV-irradiés sperme (aucune contribution d&#39;ADN pour la descendance). L&#39;utilisation de gants est facultatif. Certaines personnes préfèrent ne pas les porter parce qu&#39;il est plus difficile à manipuler les grenouilles (glissante) et en fait il semble rendre les grenouilles inconfortable. 2. Purification de gp96 du 15 / 0 tumorale (tumeur exprime à la fois et Minor H-Ags) Gp96 purification a été décrit précédemment 2, 3. En bref, gp96 est purifiée par fractionnement au sulfate d&#39;ammonium à 50-70%, suivie par conA-sépharose et DEAE chromatographie. Environ 20-50 mg de protéine peut être obtenue par 1 ml de tissu tumoral. Pureté de la préparation est déterminé par SDS-PAGE et coloration ruban. 3. Élicitation et la récolte des leucocytes péritonéale (PL) de mineurs H-Ag-disparates LG-6 Grenouilles <ol><li> Cultiver une nuit de 25 ml E. La culture Coli dans un tube conique de 50 ml à 37 ° C avec agitation. </li><li> Le jour suivant, la chaleur tue les bactéries en la faisant bouillir pendant 1 heure. </li><li> Centrifuger la chaleur a tué E. Coli pendant 15 min à 2000 rpm (1500 g) à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant et remettre le culot bactérien en 1 / 10 ème du volume de culture d&#39;origine (2,5 ml) dans APBS. A ce point la culture bactérienne est prêt à être utilisé et doit être utilisé dans les 24 heures. </li><li> Injecter par voie intrapéritonéale (IP) 200 (pour une grenouille 2 pouces) ou 300 ul (pour une grenouille 3 pouces) de l&#39;tuées par la chaleur préparation bactérienne par grenouille en utilisant une jauge de 25 5 / 8 aiguille. </li><li> Trois jours après l&#39;injection PL sont récoltés par lavage intrapéritonéale. </li><li> Avant la récolte PL, les grenouilles adultes sont anesthésiés par immersion dans une solution aqueuse à 0,1% du méthane sulfonate tricaïne (TMS, MS-222) tamponnée avec du bicarbonate de sodium pour 5 min jusqu&#39;à ce que tout mouvement cesse (la durée dépend de la taille et l&#39;âge). Animaux réveille dans les 10-20 min après le traitement. </li><li> Désinfecter l&#39;abdomen de la grenouille avec une petite quantité d&#39;éthanol à 70%. </li><li> Injecter 5 ml (pour une grenouille 2 po) ou 10 ml (pour une grenouille 3 pouces) de APBS stériles pré-chauffé à température ambiante dans la cavité péritonéale à l&#39;aide d&#39;une jauge 18 1 ½ aiguille. Retirez l&#39;aiguille et masser doucement la grenouille pendant une minute pour s&#39;assurer que le tampon injecté s&#39;équilibre avec le liquide dans la cavité du corps. </li><li> Utilisez un nouveau calibre 18 1 ½ aiguille sans seringue pour recueillir le liquide péritonéal qui va goutte à goutte de l&#39;arrière de l&#39;aiguille dans un récipient propre de 50 ml tube conique. Assurez-vous de récupérer autant du volume initial injecté que possible. Soyez prudent pour éviter les vaisseaux sanguins dans la zone centrale de la région abdominale. </li><li> Une fois que les MDD sont récoltées mettre la grenouille dans un récipient avec de l&#39;eau peu profonde jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit éveillé à quel point il peut être remis dans sa cage. </li></ol> 4. Transfert adoptif de pulsation et de Lg-6 Pls Into Naïve Lg-6 récipiendaires <ol><li> Lavez le PLS fois avec APBS froide et les centrifuger à 1000 rpm (750 g) pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant et remettre le PLS dans APBS. </li><li> Impulsion du PLS avec gp96 à une concentration de 1 ug gp96 par 5 x 10 5 MDD. </li><li> Une fois que la quantité appropriée de gp96 est ajouté à la PLS, les mélanger par pipetage et incuber sur de la glace pendant 1 heure. </li><li> Centrifuger les cellules soit à 1000 rpm pendant 10 min à 4 ° C ou à 14 000 rpm pendant 1 min pour éliminer toute Unbound gp96. </li><li> Lavez le PLS 3X avec APBS froide pour s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;ya pas résiduelle gp96 gauche. </li><li> Resuspendre le PLS pulsé à une concentration de 5 x 10 5 PL par 300 ul. </li><li> Adoptive transfert de PL par injection ip à l&#39;aide de calibre 25 5 / 8 aiguille. Injecter 300 ul des MDD pulsé (5 x 10 5 cellules) par animal. </li><li> Les grenouilles ont besoin d&#39;être amorcée au moins 3 jours avant de continuer avec greffe de peau ou des expériences défi tumeur. </li></ol> 5. Assay Skin Graft Rejet de greffe de peau est un test bien établi chez Xenopus 4, 5, 6. Chez le xénope, un destinataire rejette la peau des bailleurs de fonds affichant 1 ou 2 inadéquation haplotype CMH au sein de 18-22 jours à 21-22 ° C. En revanche, les greffes de peau entre LG et LG-6-15 clones qui ne diffèrent que par un mineur H-Ags sont rejetés plus lentement (plus que 30 jours). Toutefois, ce rejet est accéléré chez les receveurs de that ont été amorcées contre les donneurs mineurs H-Ags soit par une greffe de peau précédentes ou par immunisation avec gp96 purifiée à partir du donneur. Pas de rejet à tout produit lorsque le donneur et le receveur sont génétiquement identiques (par exemple, les animaux clonés ou totalement consanguins). Par conséquent, cette technique simple est très puissante pour caractériser in vivo les réponses immunitaires induites par gp96. <ol><li> Anesthetize grenouille donateurs comme décrit dans 3.7. Remarque: Seul un minimum de précautions doivent être prises depuis Xenopus produire de puissants peptides anti-microbiens (par exemple, magainine) dans la peau qui évite la nécessité d&#39;asepsie totale. En fait, le traitement de la grenouille avec un désinfectant serait néfaste pour la peau. En outre, les Xenopus n&#39;ont pas de pathogènes qui peuvent être transférées aux humains. Par conséquent, l&#39;utilisation de gants est facultatif. Cependant, tous les instruments de dissection utilisés doivent être autoclavés et toutes les solutions doivent être stériles. </li><li> Couper et enlever une petite (20 mm x 5 mm) morceau de peau ventrale (peau de l&#39;abdomen qui apparaît argenté dû à la présence de cellules pigmentées irridophore) d&#39;une grenouille donateurs LG-15 à l&#39;aide des ciseaux. </li><li> Placez la peau dans un APBS PetriDish contenant et le garder sur la glace. Manipuler les tissus de la peau très doucement, éviter le tenant entre les deux pinces. </li><li> En utilisant une lame de rasoir ou des ciseaux couper greffes individuelles en morceaux de 5 mm x 5 mm. Gardez les fragments dans APBS sur la glace. </li><li> À ce stade de la grenouille donneur est placée dans un récipient avec de l&#39;eau peu profonde jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit éveillé et il est alors placé dans de l&#39;eau contenant des antibiotiques (Penstrep à une concentration de 5 mg / L). La grenouille est conservé dans de l&#39;eau avec des antibiotiques pendant deux jours à quel point il est retourné dans l&#39;eau normale. La petite plaie à l&#39;endroit où la peau a été retirée n&#39;a pas besoin d&#39;être cousu et guérit en une semaine. </li><li> Anesthetize le destinataire LG-6 grenouille. </li><li> Faire une petite incision sur la dorsale (dos) la peau du destinataire et de l&#39;insertion du greffon 5 mm x 5 mm sous la peau avec le côté argenté en place. Soyez prudent de ne pas introduire grosses bulles d&#39;air sous la peau car cela peut conduire à des déplacements ou même la perte du greffon. </li><li> Assurez-vous noter les inscriptions à ciseaux et des pinces sur les greffons, car ceux qui ne sont pas comptés comme un rejet du greffon une fois que la notation commence. </li><li> 24 heures plus tard une partie de la peau de l&#39;hôte superposant doit être retiré de la greffe. </li><li> Anesthetize le destinataire LG-6 grenouille. Manipuler l&#39;animal tel que décrit en 5.1. </li><li> Avec des ciseaux autoclavé découper une fenêtre autour de la greffe de sorte que la greffe peut être librement visualisées. Soyez prudent de ne pas toucher la peau donateur ou à provoquer le saignement. Laissez la grenouille de récupérer comme décrit en 5.5. </li><li> Commencer à marquer la greffe d&#39;emblée en prenant un croquis. Rejet de greffe de la peau est déterminée par le pour cent de la destruction de la irridophores sur la peau greffée. </li><li> Les greffons doivent être vérifiés tous les 2-3 jours, mais les animaux n&#39;ont pas besoin d&#39;être anesthésié pour cela. Pour visualiser les greffes, les grenouilles ont besoin d&#39;être placé dans un PetriDish sous un microscope à dissection. </li></ol> 6. Whole-Mont Immunohistologie du peau transplantée Grenouille toute monture immunohistologie a été décrit précédemment 6. En bref, la grenouille est anesthésié et placé sous le microscope sur une serviette en papier stériles pré-mouillée avec de l&#39;eau grenouille (la zone de travail est également de manière aseptique). La peau est ensuite transplanté récolté avec une petite quantité de peau environnante hôte et il est coloré avec des anticorps similaire à coloration des cellules pour l&#39;analyse de cytométrie en flux 6. Instruments à l&#39;autoclave et tampons stériles doivent être utilisés. Après coloration de la peau est placée sur une lame de microscope et délicatement pressé avec une lamelle. À ce stade de la peau peuvent être visualisées en utilisant un microscope à fluorescence pour les différentes populations de cellules qui ont infiltré la greffe. Après la procédure de la grenouille est conservé dans de l&#39;eau avec des antibiotiques tels que décrits dans la section 5.5. et est retourné dans l&#39;eau normale. La petite blessure à gauche où la peau a été enlevée guérit en une semaine. 7. Caractérisation des leucocytes du sang <ol><li> Avant de retirer le sang de la grenouille, on a besoin pour préparer des «aiguilles de verre&quot; en tirant stériles Pipettes Pasteur au cours de la flamme. L&#39;extrémité de la pipette fines est aiguisée sous la loupe binoculaire. La pipette est alors relié à un tube en plastique d&#39;aspiration. Tous les instruments tels que les pinces et de ciseaux doivent être autoclavés avant usage. </li><li> Préparez aussi glacée 10 ml de solution d&#39;héparine APBS et en ajoutant 50 unités d&#39;héparine par 1 mL d&#39;APBS. Conserver la solution sur la glace. Toutes les solutions utilisées doivent être stériles. </li><li> Anesthetize grenouille comme décrit dans 3.7, et suivez les mêmes procédures de manipulation des animaux tels que décrits au paragraphe 5.1. . </li><li> Coupez la peau au-dessus des pieds postérieurs à exposerla veine dorsale du tarse. </li><li> Remplir la pipette Pasteur avec 1-2 ml de solution d&#39;héparine APBS +. </li><li> Insérez le «aiguille de verre&quot; dans la veine et commencer à recueillir le sang par aspiration lentement avec la bouche. Il est important d&#39;avoir APBS solution + héparine dans le «aiguille de verre&quot; car cela éviter la coagulation du sang et de colmatage de la pointe de l&#39;aiguille. </li><li> 1 à 2 mL de sang peuvent être obtenues d&#39;une grenouille de taille moyenne. </li><li> La petite incision sur la jambe de la grenouille n&#39;a pas besoin d&#39;être cousu et la blessure guérit en une semaine. </li><li> Centrifuger le sang à 1000 rpm pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Enlever le surnageant et laver les cellules 1X avec 10 mL d&#39;APBS froid. </li><li> Recouvrir avec 2 ml de sang (1-5 x 10 6 cellules) sur 1 ml de Ficoll Histopaque 1,077 (Sigma) préchauffé à la température ambiante afin de séparer les leucocytes du sang à partir des cellules rouges du sang. </li><li> Centrifuger 20 min à 1000 rpm à température ambiante, sans frein, et recueillir ensuite la bande des leucocytes. </li><li> Laver les cellules 2X avec APBS par centrifugation à 1400 rpm pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer l&#39;ficoll résiduelle. </li><li> À ce stade, les cellules sont prêtes à être colorées avec des anticorps pour l&#39;analyse de cytométrie en flux, ou pour être utiliser pour des essais en culture in vitro. </li></ol> 8. Tumeur Assay transplantation <ol><li> Environ une semaine avant le dégel expérimentation sur un nouveau lot de cellules 15 / 0 de la tumeur et de s&#39;assurer que les cellules commencent à se développer ainsi. Le milieu de culture est succinctement décrite dans la section suivante et de façon plus détaillée dans 3. </li><li> Développer les cellules 15 / 0 tumeur. </li><li> Le jour de l&#39;expérience, un comptage des cellules et détermine la mort cellulaire par exclusion du bleu trypan. La mort cellulaire doit être inférieure à 5%. Laver les cellules 1X dans APBS froid, et centrifuger à 1000 rpm à 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Resuspendre les cellules tumorales dans le milieu de culture à une densité de 5 x 10 5 15 / 0 300 cellules par mL. </li><li> Transplant 5 x 10 5 cellules dans 300 ul par volume de grenouille par injection sous-cutanée à l&#39;aide d&#39;une jauge 25 5 / 8 aiguille sur un côté de la dorsale (dos) côté de l&#39;animal. </li><li> La croissance tumorale commencera dans les 2-3 semaines après l&#39;épreuve tumeur. L&#39;apparition de la tumeur primitive doit être noté et le volume de la tumeur a besoin d&#39;être enregistrés tous les 2-3 jours. Le volume des tumeurs (hauteur x longueur x largeur) est mesurée à l&#39;aide des étriers. </li><li> Une fois que la tumeur se développe à 3.500 mm 3 ou la grenouille commence à chercher léthargique, il doit être euthanasié pour éviter la gêne. </li></ol> 9. Réactifs nécessaires: <ul><li> Amphibian tampon phosphate salin (APBS): 6,6 g / L de NaCl, 1,15 g / L de Na 2 HPO 4, 0,2 g / L KH 2 PO. pH à 7,5 à l&#39;aide de NaOH 10N et stérilisé par filtration à travers filtre de 0,2 um. </li><li> Méthanesulfonate de tricaïne (TMS, MS-222) (Croissant recherche CAS # 886-86-2 produits chimiques). </li><li> Le bicarbonate de sodium (Fisher Scientific S-233-500). </li><li> Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich 10771-100 ml) </li><li> Sel de sodium d&#39;héparine (Sigma-Aldrich H3149-50KU) </li><li> Milieu de culture pour Xenopus 15 / 0 tumeurs [voir 3 pour plus de détails]: 1 L de milieu DMEM Iscove basale (Gibco Invitrogen-11965) avec 10 mL d&#39;insuline, 10 ml non acides aminés essentiels, 10 ml de pénicilline-streptomycine; 10 ug / ml de kanamycine; 3 mL de Primatone (Sheffield Products Division), 1 mL de β2-mercaptoéthanol et 3,02 g de NaHCO 3 dans l&#39;eau (pH 7,0). Ce milieu est dilué à l&#39;osmolarité des amphibiens en ajoutant 30% d&#39;eau bidistillée, et supplémenté avec 5% de sérum de veau fœtal, superantant 20% d&#39;une A6 reins Xenopus lignée cellulaire, et 0,25% de la normale Xenopus sérum. </li></ul> 10. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Stéréomicroscopique analyse du rejet de greffe de peau 12 jours après la transplantation. LG-6 grenouille clonée a reçu une greffe de peau provenant soit (A) un MHC-identiques LG-6 (ne montre aucun rejet) ou (B) d&#39;un donneur MHC-disparates consanguine (80% de rejet). Les flèches montrent des cellules pigmentées iridophore argentée marquage en bonne santé (non-rejet) greffé des tissus. (*) Marque de pince pas due à un rejet. <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Gp96 facilite la présentation croisée d&#39;antigènes tumoraux chez le Xénope. LG PL-15 (5 x 10 5) ont été puisées pendant 1 h sur la glace, soit avec APBS (contrôle négatif), 1 ug de recombinaison gp96 purifié à partir d&#39;un E. G la culture Coli, ou 1 ou 0.5 de gp96 purifiée à partir de 15 / 0 tissu tumoral. Après 3 lavages, les cellules ont été transférées dans adoptive receveurs adultes LG-15 (1 x 10 6 / personne). Trois jours plus tard, en direct 15 / 0 cellules tumorales (5 x 10 5) ont ététransplantés par injection sous-cutanée. Chaque courbe représente la cinétique de croissance tumorale chez une grenouille. Défi jours après lorsque les tumeurs ont été suivis première apparition, et la taille des tumeurs a été déterminé périodiquement avec un (longueur x largeur x épaisseur) étrier.

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	<li>Kobel, H. R., Pasquier, D. u., L, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperdiploid+species+hybrids+for+gene+mapping+in+Xenopus.">Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus.</a> Nature. 279, 157-158 (1979).</li><li>Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+conservation+of+the+molecular+and+immunological+properties+of+the+chaperones+gp96+and+hsp70.">Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70.</a> Eur J Immunol. 31, 186-195 (2001).</li><li>Robert, J., Gantress, J., Cohen, N., Maniero, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+as+an+experimental+model+for+studying+evolution+of+hsp--immune+system+interactions.">Xenopus as an experimental model for studying evolution of hsp--immune system interactions.</a> Methods. 32, 42-53 (2004).</li><li>Chardonnens, X., Pasquier, D. u., L, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+skin+allograft+tolerance+during+metamorphosis+of+the+toad+Xenopus+laevis:+a+possible+model+for+studying+generation+of+self+tolerance+to+histocompatibility+antigens.">Induction of skin allograft tolerance during metamorphosis of the toad Xenopus laevis: a possible model for studying generation of self tolerance to histocompatibility antigens.</a> Eur J Immunol. 3, 569-573 (1973).</li><li>Du Pasquier, L., Bernard, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+suppression+of+the+allogeneic+histocompatibility+reactions+during+the+metamorphosis+of+the+clawed+toad+Xenopus.">Active suppression of the allogeneic histocompatibility reactions during the metamorphosis of the clawed toad Xenopus.</a> Differentiation. 16, 1-7 (1980).</li><li>Ramanayake, T., Simon, D. A., Frelinger, J. G., Lord, E. M., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+study+of+T-cell+responses+to+skin+alloantigens+in+Xenopus+using+a+novel+whole-mount+immunohistology+method.">In vivo study of T-cell responses to skin alloantigens in Xenopus using a novel whole-mount immunohistology method.</a> Transplantation. 83, 159-166 (2007).</li><li>Robert, J., Ramanayake, T., Maniero, G. D., Morales, H., Chida, A. S., S, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+conservation+of+glycoprotein+96+ability+to+interact+with+CD91+and+facilitate+antigen+cross-presentation.">Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation.</a> J Immunol. 180, 3176-3182 (2008).</li><li>Robert, J., Gantress, J., Rau, L., Bell, A., Cohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minor+histocompatibility+antigen-specific+MHC-restricted+CD8+T+cell+responses+elicited+by+heat+shock+proteins.">Minor histocompatibility antigen-specific MHC-restricted CD8 T cell responses elicited by heat shock proteins.</a> J Immunol. 168, 1697-1703 (2002).</li><li>Morales, H., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+techniques+for+comparative+study+of+antiviral+T-cell+responses+in+the+amphibian+Xenopus.">In vivo and in vitro techniques for comparative study of antiviral T-cell responses in the amphibian Xenopus.</a> Biol Proced Online. 10, 1-8 (2008).</li><li>Maniero, G. D., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+conservation+of+gp96-mediated+antigen-specific+cellular+immunity:+new+evidence+from+adoptive+cell+transfer+in+xenopus.">Phylogenetic conservation of gp96-mediated antigen-specific cellular immunity: new evidence from adoptive cell transfer in xenopus.</a> Transplantation. 78, 1415-1421 (2004).</li></ol>

Les amphibiens Xenopus est unique polyvalent non mammifères modèle pour étudier l&#39;immunité. Son utilisation intensive dans la recherche biomédicale et immunologiques a donné de nombreux outils de recherche importants tels que les clones CMH définies LG et LG-6-15 ainsi que différentes lignées de cellules et d&#39;anticorps monoclonaux. Grâce à ces outils, nous avons établi différentes in vitro et in vivo pour étudier la capacité des protéines de choc thermique tels que gp96...

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
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		<th>Catalogue Number</th>
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<tr>
<td>Reagents needed:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl, 1.15 g/L </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Na2HPO4, 0.2 g/L </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KH2PO </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10N NaOH </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Crescent Research Chemicals </td>
<td>CAS#886-86-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium bicarbonate </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>S-233-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histopaque-1077</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>10771</td>
<td>100ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Heparin Sodium Salt </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich </td>
<td>H3149-50KU</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Iscove DMEM basal medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco-Invitrogen </td>
<td>11965</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kanamycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Primatone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sheffield Products Division</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;2-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHCO3 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30% double distilled water </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5% featal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25% of normal Xenopus serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Materials and Equipment:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>18 gauge 1&frac12; Precision Glide sterile needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml Slip Tip Syringe sterile</td>
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<td>BD</td>
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<td>1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile)</td>
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<td>60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile</td>
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<td>Falcon</td>
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<td>Razor blades</td>
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<td>25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides </td>
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<td>Fisher Scientific</td>
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<td>10 cm glass petri dishes</td>
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<td>9" Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable</td>
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<td>VWR</td>
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<td>Tygon tubing</td>
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<td>Two # 5 Swiss Jeweler&#x2019;s Forceps</td>
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<td>Miltex Inc.</td>
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<td>Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm</td>
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<td>Roboz</td>
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<td>Helios calipers </td>
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<td>Dissecting microscope</td>
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<td>High intensity illuminator</td>
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<td>Hemacytometer</td>
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<td>Un-bunsen burner</td>
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<td>37&deg;C shaking incubator</td>
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<td>Centrifuge</td>
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comparative in vivo study of gp96 adjuvanticity in the frog xenopus laevis

Nous avons développé dans le Xenopus laevis amphibiens unique non mammifères modèle pour étudier la capacité de certaines protéines de choc thermique (HSP), tels que gp96 pour faciliter la présentation croisée des antigènes chaperonné et susciter innée et adaptative réponses des lymphocytes T. Rejet de greffe de peau de Xenopus fournit une excellente plateforme pour étudier la capacité de gp96 à susciter classiques du CMH de classe Ia (classe Ia) restreint les réponses des cellules T. De plus, le système modèle Xénope fournit également une alternative intéressante à la souris pour explorer la capacité de gp96 à générer des réponses contre les tumeurs qui ont régulé à la baisse de leurs molécules de classe Ia échappant ainsi à la surveillance immunitaire. Récemment, nous avons développé une méthode de criblage cellulaire adoptive de transfert en utilisant des clones de Xenopus leucocytes péritonéale comme des cellules présentatrices d&#39;antigène (CPA), et montré que gp96 peut Premier réponses des lymphocytes T CD8 in vivo contre des antigènes mineurs d&#39;histocompatibilité de peau ainsi que contre la tumeur du thymus Xenopus 15 / 0 qui n&#39;exprime pas les molécules Ia classe. Nous décrivons ici la méthodologie utilisée pour effectuer ces tests, y compris le transfert d&#39;élicitation, pulsant et adoptive de leucocytes péritonéale, ainsi que la greffe de peau et des essais de transplantation de tumeurs. De plus nous sommes également décrit la récolte et la séparation des leucocytes du sang périphérique utilisé pour la cytométrie de flux et de tests de prolifération qui permettent une caractérisation plus poussée des populations effectrices impliquées dans le rejet de la peau et des réponses antitumorales.

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Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

La grenouille<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Fournit une intéressante alternative non-mammifère modèle pour explorer la capacité de la protéine de choc thermique tels que gp96 à promouvoir spécifiques de l&#39;antigène des cellules T CD8. Nous présentons des méthodes pour étudier<em&gt; In vivo</emFacilitation&gt; des présentation croisée d&#39;antigènes tumoraux par la peau et gp96.

Comparative In vivo Etude de gp96 adjuvanticité de la grenouille Xenopus laevis</em

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

10.5K vues.  University of Rochester. La grenouille Xenopus laevis Fournit une intéressante alternative non-mammifère modèle pour explorer la capacité de la protéine de choc thermique tels que gp96 à promouvoir spécifiques de l'antigène des cellules T CD8. Nous présentons des méthodes pour étudier In vivo des présentation croisée d'antigènes tumoraux par la peau et gp96.

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In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

L&#39;imagerie in vivo des parasites Leishmania transgéniques dans un hôte en direct

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Recherche

Immunologie et infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

L&#39;imagerie non invasive des Homing leucocytes et des migrations In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of lesion size is a hard procedure and animals show difficulty to eat, breathe and move because of the lesion. In order to optimize the hamster model for cutaneous leishmaniasis, young adult male and female golden hamsters (Mesocricetus auratus) were injected intradermally at the dorsal skin with 1 to 1.5 x l07 promastigotes of Leishmania species and progression of subsequent lesions were evaluated for up to 16 weeks post infection. The golden hamster was selected because it is considered the adequate bio-model to evaluate drugs against Leishmania as they are susceptible to infection by different species. Cutaneous infection of hamsters results in chronic but controlled lesions, and a clinical evolution with signs similar to those observed in humans. Therefore, the establishment of the extent of infection by measuring the size of the lesion according to the area of indurations and ulcers is feasible. This approach has proven its versatility and easy management during inoculation, follow up and characterization of typical lesions (ulcers), application of treatments through different ways and obtaining of clinical samples after different treatments. By using this method the quality of animal life regarding locomotion, search for food and water, play and social activities is also preserved.

Optimization of the experimental hamster model for cutaneous leishmaniasis by intradermal injection of Leishmania promastigotes at the dorsal skin. This approach is useful during inoculation, follow-up, characterization of lesions, application of treatments and obtaining of clinical samples. Locomotion, search for food and water, play and social activities are preserved.

La leishmaniose cutanée dans la peau dorsale de Hamsters: un modèle utile pour le dépistage des drogues antileishmanienne

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia de culture du système nerveux central néonatale et de l&#39;adulte

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro et in vivo modèle pour étudier l&#39;adhésion bactérienne au navire muraux dans des conditions de débit

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Cultures placentaire et déciduale organe humain pour l&#39;étude des infections à l&#39;interface materno-fœtale

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Rétrovirale transduction des cellules T auxiliaires comme une approche génétique pour étudier les mécanismes contrôlant leur différenciation et la fonction

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Échantillonnage non invasive de muqueuse liquide pour la Quantification des niveaux d’immunitaire-médiateur In Vivo des voies respiratoires supérieures

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

Quantifier la chimiotaxie Monocyte humain In Vitro et lymphocytes murins traite In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.