Tina Martin ve David Albright tarafından sağlanan uzman hayvancılık minnetle takdir edilmektedir. Bu araştırma, NIH hibe T32-AI-07.285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCK), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059.830-06 tarafından desteklenmiştir.

1. Hayvanlar X. laevis x X Gilli melezleri LG-6 ve LG-15 isogenetic klonlar 1 University of Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm) üreyen koloni. LG-6 ve LG-15 payı aynı heterozigot MHC haplotip (a / c), ancak küçük histokompatibilite (H) lokusların farklı. Bu klonlar Döl diploid yumurta dişi tarafından üretilen UV ışınlanmış sperm (döl hiçbir DNA katkısı) tarafından aktive edildiği gynogenesis tarafından üretilmektedir. Eldiven kullanımı fakültatif. Bazı insanlar kurbağaların işlemek için daha zordur (kaygan) ve aslında kurbağaları rahatsız görünüyor, çünkü onları giymek için tercih ediyor. 2. Tümör 15 / 0 (tümör H-Ag Minor ifade) saflaştırılması gp96 Gp96 arıtma, daha önce 2, 3 tarif edilmiştir. Kısaca, gp96 CONA-sepharose ve DEAE kromatografisi% 50-70 amonyum sülfat fraksiyonasyon arındırılır. Protein, 20-50 mg 1 ml tümör dokusu başına elde edilebilir. Hazırlık Saflık SDS-PAGE ve şerit boyama tarafından belirlenir. 3. Minör H-Ag-LG-6 Kurbağalar birbirinden farklı Periton lökositler (PL) ortaya çıkarılması ve Hasat <ol><li> 25 ml gecede E. büyütün 37 50 ml konik bir tüp içinde Coli kültür ° C sallayarak ile . </li><li> Ertesi gün ısı 1 saat kaynatarak bakterileri öldürmek. </li><li> E. öldürülen ısı Santrifüj 2,000 rpm (1.500 g), 4 ° C 15 dakika için Coli </li><li> Süpernatantı ve 1 / 10 th APBS özgün kültür hacmi (2,5 ml) bakteriyel pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Bu noktada bakteri kültürü kullanıma hazırdır ve 24 saat içinde kullanılması gerekir. </li><li> Intraperitoneal (ip) 200 (2 inç kurbağa için) veya 25 gauge 5 / 8 iğne kullanarak kurbağa ortalama ısı ile öldürülmüş bakteri hazırlık 300 mcL (3 inç kurbağa için) enjekte edilir. </li><li> Intraperitoneal lavaj enjeksiyon PL üç gün sonra hasat edilir. </li><li> PL hasat önce tüm hareketleri geçene kadar (süre boyutu ve yaş bağlıdır), erişkin kurbağalar, 5 dakika kadar sodyum bikarbonat ile tampon tricaine metan sülfonat (TMS, MS-222),% 0.1 &#39;lik sulu çözelti daldırma tarafından anestezi. Hayvanlar tedaviden sonra 10-20 dakika içinde uyanıyorum. </li><li> Kurbağa karın% 70 etanol küçük bir miktarı ile dezenfekte edin. </li><li> 5 ml (2 inç kurbağa için) ya da 10 ml steril APBS oda sıcaklığında 18 gauge 1 ½ iğne kullanarak periton boşluğuna önceden ısıtılmış (3 inç kurbağa için) enjekte edilir. İğneyi çıkarın ve vücut boşluğunda sıvı enjekte tampon equilibrates sigortalamak için bir dakika kurbağa hafifçe masaj yapın. </li><li> Temiz bir 50 ml konik tüp içine iğne arka damla periton sıvısı toplamak için bir şırınga olmadan yeni bir 18 gauge 1 ½ iğne kullanın. Ilk enjekte edilen hacim olarak mümkün olduğunca çok almak emin olun. , Karın bölgesi, merkezi bir bölgede kan damarları önlemek için dikkatli olun. </li><li> Onun kafesine geri konabilir bu noktada uyanık kadar sığ su ile bir kap içinde bir kez PL kurbağa hasat edilir. </li></ol> 4. Lg-6 Pls Naive Lg-6 Alıcılar içine attığı Kabul edilmiş Transferi <ol><li> PL soğuk APBS ile bir kez yıkayın ve 10 dakika 4 ° C için 1.000 rpm (750 g) santrifüj </li><li> Süpernatantı ve APBS PL tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 5 x 10 5 PL başına 1 mg gp96 bir konsantrasyon gp96 PL Pulse. </li><li> Gp96 uygun miktarda PL eklendikten sonra 1 saat pipeting ve buz üzerinde inkübe karıştırın. </li><li> Bağlanmamış gp96 kaldırmak için 1000 rpm 10 dakika 4 ° C ya da 1 dakika 14.000 rpm&#39;de hücreleri santrifüjleyin. </li><li> Hiçbir kalıntı gp96 sol olmadığından emin olmak için soğuk APBS 3X PL yıkayın. </li><li> Darbeli PL 300 mcL başına 5 x 5 10 PL bir konsantrasyon tekrar </li><li> PL Adoptively 25 gauge 5 / 8 iğne kullanarak ip enjeksiyon yoluyla aktarın. Darbeli PL (5 x 10 5 hücre) hayvan başına 300 mcL enjekte edilir. </li><li> Kurbağalar, deri grefti ya da tümör meydan deneyleri ile devam etmeden önce en az 3 gün astarlanmalıdır gerekir. </li></ol> 5. Cilt Greft Testi Deri grefti reddi Xenopus 4, 5, 6, köklü bir testtir. Xenopus, alıcının, 21-22, 18-22 gün içinde 1 veya 2 MHC haplotip uyumsuzlukları displaying bağış deri ° C reddeder Buna karşılık, LG-6 ve sadece küçük H-Ag tarafından farklı LG-15 klonları arasında deri grefti (fazla 30 gün olduğunu) daha yavaş reddedilir. Ancak, bu ret alıcıları tha hızlanırt önceki bir deri grefti ya da donör arınmış gp96 ile bağışıklama ya donör küçük H-Ag karşı astarlanmış edilmiştir. Hiç ret verici ve alıcının genetik (klonlanmış, örneğin ya da tamamen kendilenmiş hayvanlar) aynı zaman oluşur. Bu nedenle, bu basit tekniği, in vivo immün yanıtları karakterize gp96 tarafından ortaya çok güçlü . <ol><li> 3.7 &#39;de açıklandığı gibi donör kurbağa anestezisi. Not: Xenopus toplam aseptik işlemler için ihtiyacı ortadan kaldırır ciltte güçlü anti-mikrobiyal peptidler (örneğin, magainin) üreten bu yana sadece minimum önlemler alınması gerekir. Aslında, herhangi bir dezenfektan ile kurbağa tedavisi, cilt için zararlı olacaktır. Buna ek olarak, insanlar için transfer edilebilir herhangi bir patojenlerin Xenopus zorunda değilsiniz . Bu nedenle, eldiven kullanımı isteğe bağlıdır. Ancak, kullanılan tüm diseksiyon aletleri otoklava gereken ve tüm çözümler, steril olması gerekir. </li><li> Makas kullanarak LG-15 donör kurbağa ventral deri parçası (irridophore pigmentli hücrelerin varlığı nedeniyle gümüşi görünen karın cilt) (X 5 mm 20 mm) kesin ve küçük bir çıkarın. </li><li> Petridish içeren APBS cilt koyun ve buz üzerinde tutmak. Çok nazik deri dokusunun işleyin; forseps arasında tutarak önlemek. </li><li> Bir jilet veya makas kullanmak, 5 mm X 5 mm adet bireysel greft içine kesti. Buz üzerinde APBS parçaları tutun. </li><li> Bu noktada uyanık antibiyotikler (5 mg / L konsantrasyonu az Penstrep) içeren su konur ve ardından kadar donör kurbağa sığ su ile bir kap konur. Kurbağa, iki gün boyunca normal su döndürülür noktası antibiyotik ile su tutulur. Cilt kaldırıldı yerinde küçük bir yara dikili olması gerekir ve bir hafta içinde iyileşir değildir. </li><li> Alıcı LG-6 kurbağa anestezisi. </li><li> Alıcının dorsal (arka) cilt üzerinde küçük bir kesi yapın ve gümüşi tarafı ile cilt altında 5 mm x 5 mm greft yerleştiriniz. Deplasman hatta greft kaybına yol açabilir, çünkü cilt altında büyük hava kabarcıkları tanıtmak için değil, dikkatli olun. </li><li> Puanlama başladığında bu greft reddi olarak sayılmaz çünkü greft makas ve forseps işaretler not emin olun. </li><li> 24 saat sonra kaplanacağı ana cildin bir parçası greft kaldırılması gerekiyor. </li><li> Alıcı LG-6 kurbağa anestezisi. 5.1 &#39;de açıklandığı gibi hayvan tutun. </li><li> Greft serbestçe görüntülenmiştir böylece otoklavlanmış makas kullanılması greft etrafında bir pencere kesip. Donör cilde dokunmak veya kanamaya neden dikkatli olun. 5.5 &#39;de açıklandığı gibi kurbağa kurtarmak olsun. </li><li> Bir kroki alarak greft puanlama hemen başlayın. Cilt greft reddi aşılı cilt irridophores imha yüzde belirlenir. </li><li> Greftler, her 2-3 günde bir kontrol edilmesi gerekiyor, ancak bu hayvanların anestezi gerekmez. Greft görselleştirmek için, kurbağa diseksiyon mikroskobu altında bir petridish yerleştirilmesi gerekir. </li></ol> 6. Tüm montaj nakledilen Cilt İmmunohistolojik Kurbağa bütün montaj İmmunohistolojik daha önce 6 tarif edilmiştir. Kısaca, kurbağa, anestezi ve steril bir kağıt havlu üzerine kurbağa su (çalışma alanı da aseptik olarak hazırlanmış) ile ön ıslak mikroskop altında yerleştirilir. Nakledilen deri daha sonra ev sahibi cilt çevreleyen küçük bir miktar ile birlikte hasat ve benzer antikorların akış sitometri analizi 6 için hücre boyama ile boyandı. Otoklavlı aletleri ve steril tamponlar kullanılması gerekir. Deri boyama sonra bir mikroskop lamı üzerine yerleştirilir ve yavaşça bir kapak kayma ile bastırdı. Bu noktada deri grefti sızmışlar farklı hücre popülasyonlarının floresan mikroskop kullanılarak görüntülendi olabilir. İşlemden sonra kurbağa bölüm 5.5 &#39;de açıklandığı gibi, antibiyotik ile su tutulur. ve normal su döndü. Cilt kaldırıldı bıraktığı yerde küçük bir yara, bir hafta içinde iyileşir. 7. Kan lökosit Karakterizasyonu <ol><li> Kurbağa kan çıkarmadan önce, bir ateşte steril Pasteur pipetler çekerek &quot;cam iğneler&quot; hazırlamak gerekiyor. Pipet ince ekstremite stereomicroscope altında bilenmiş. Pipet sonra bir aspirasyon plastik tüp bağlıdır. Forseps ve makas gibi tüm araçları kullanmadan önce otoklava gerekir. </li><li> Ayrıca APBS, 1 ml başına heparin 50 ünite ekleyerek APBS ve heparin çözüm buz 10 ml hazırlamak. Çözüm buz üzerinde tutun. Kullanılan tüm çözümler, steril olması gerekir. </li><li> 3.7 &#39;de açıklandığı gibi kurbağa anestezisi, ve 5.1&#39; de açıklandığı gibi aynı hayvan işlemleri uygulayın. . </li><li> Kes cilt ortaya çıkarmak için arka ayak üstündedorsal tarsus ven. </li><li> 1-2 mL APBS + heparin çözüm Pasteur pipeti ile doldurun. </li><li> &quot;Cam iğne&quot; damar içine yerleştirin ve yavaş yavaş ağız ile aspire kan toplamaya başlar. Bu alınan kan pıhtılaşmasını ve iğne ucu tıkanmasını önlemek çünkü &quot;cam iğne&quot; APBS + heparin çözüm olması önemlidir. </li><li> 1 2 mL kan, bir ortalama büyüklükteki kurbağa elde edilebilir. </li><li> Kurbağa bacağı üzerinde küçük bir kesi dikilir olması gerekmez ve bir hafta içinde yara iyileşir. </li><li> 1000 rpm&#39;de 10 dakika süreyle kan Santrifüj 4 ° C </li><li> Süpernatantı ve soğuk APBS 10 ml 1X hücreleri yıkayın. </li><li> Ficoll Histopaque 1,077 (Sigma), kırmızı kan hücreleri kan lökosit ayırmak için oda sıcaklığında önceden ısıtılmış 1 ml üzerine kan Yerleşimi 2 mL (1-5 x 10 6 hücre) . </li><li> Herhangi bir fren ile oda sıcaklığında 1000 rpm&#39;de 20 dakika santrifüj, ve sonra lökosit bant toplamak. </li><li> 4 10 dakika 1400 rpm&#39;de santrifüj yoluyla APBS ile 2X hücreleri yıkayın ° C kalan Ficoll kaldırmak. </li><li> Bu noktada hücreler flow sitometri analizi için antikorlar ile boyanarak hazır, ya da in vitro kültür analizleri için kullanılacak olması . </li></ol> 8. Tümör Nakli Testi <ol><li> Yaklaşık bir hafta önce yeni bir 15 / 0 tümör hücrelerinin toplu ve hücreler büyümeye başlar emin olun dışarı deney çözülme. Kültür orta özlü bir sonraki bölümde ve 3 daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır. </li><li> 15 / 0 tümör hücrelerinin genişletin. </li><li> Deney günü, hücre sayımı ve Tripan mavi dışlama hücre ölümü belirlemek. Hücre ölümü% 5&#39;inden az olmalıdır. 4 1.000 rpm&#39;de soğuk APBS 1X hücreleri ve santrifüj yıkayın ° C 10 dakika. </li><li> 300 mcL başına 5 x 5 10 15 / 0 hücre yoğunluğu, tümör kültür ortamı hücreleri tekrar </li><li> Nakli 5 hayvanın sırt (arka) kısmı bir tarafta 25 gauge 5 / 8 iğne ile cilt altı enjeksiyonu ile kurbağa başına 300 mcL hacmi x 10 5 hücre . </li><li> Tümör büyüme tümör meydan sonra 2-3 hafta içinde başlayacak. Ilk tümör görünüm belirtti ve tümör hacmi 2-3 günde kaydedilen gereken olmalıdır. Tümör hacmi (yükseklik X uzunluk x genişlik) kaliperler kullanılarak ölçülür. </li><li> Tümör 3.500 mm 3 büyür ya da kurbağa uyuşuk görünümlü başladıktan sonra, bu rahatsızlığı önlemek için ötenazi gerekir. </li></ol> 9 - Reaktifler Gerekli: <ul><li> 6.6 g / L NaCl, 1.15 g / L Na 2 HPO 4, 0.2 g / L KH 2 PO: Amfibi Fosfat Tamponlu Salin (APBS). 10N NaOH ve filtre kullanılarak pH 7.5 filtre 0.2 mikron ile sterilize. </li><li> Tricaine Metan sülfonat (TMS, MS-222) (Crescent Araştırma Kimyasallar CAS # 886-86-2). </li><li> Sodyum bikarbonat (Fisher Scientific S-233-500). </li><li> Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich 10.771-100 ml) </li><li> Heparin Sodyum Tuz (Sigma-Aldrich H3149-50KU) </li><li> Xenopus 15 / 0 tümörleri için kültür ortamı [3 Daha fazla bilgi için bakınız]: 10 ml İnsülin, 10 ml non-esansiyel amino asitler, 10 ml penisilin-streptomisin Iscove DMEM bazal orta 1 L (Gibco-Invitrogen 11.965); 10 mikrogram / mL Kanamisin; primatone (Sheffield Ürünleri Bölümü), β2-mercaptoethanol 1 mL ve su içinde 3.02 g NaHCO 3 (pH 7.0) 3 ml. Bu ortam,% 30 çift distile su ekleyerek amfibi ozmolarite seyreltilmiş ve% 5 fetal sığır serumu, Xenopus böbrek hücre hattı A6% 20 superantant, ve% 0.25 &#39;normal Xenopus serum ile desteklenebilir. </li></ul> 10 Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 deri grefti reddi transplantasyon sonrası 12 gün stereomicroscopic analiz. LG-6 klonlanmış kurbağa (A) aynı MHC-LG-6 ya da bir deri grefti (reddi gösterir) veya (B) birbirinden farklı MHC-outbred bir donör (80% reddi). Oklar gümüşi iridophore pigmentli hücreleri sağlıklı (non-reddedilen) aşılı doku işaretleme gösterir. (*) Mark reddi nedeniyle forsepsi. <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Gp96 Xenopus tümör antijenleri çapraz sunum kolaylaştırır. APBS (negatif kontrol), 1 mg, bir E. arınmış rekombinant gp96 ya da buz üzerinde 1 saat darbeli LG-15 PL (5 x 10 5 ) Gp96 Coli kültür, ya da 1 veya 0.5 mg 15 / 0 tümör dokusu arınmış. 3 yıkar sonra, hücreler adoptively LG-15 yetişkin alıcılara transfer edildi (1 x 10 6 / bireysel). Üç gün sonra, 15 / 0 tümör hücrelerinin (5 x 10 5) canlısc enjeksiyon yoluyla nakledilen. Her eğri bir kurbağa tümör büyüme kinetiği temsil eder. Tümörler ilk ortaya çıktıkları gün sonrası meydan monitörize edildi ve tümör boyutu, bir kaliper (uzunluk x genişlik x kalınlık) ile periyodik olarak tespit edildi.

<ol>
	<li>Kobel, H. R., Pasquier, D. u., L, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperdiploid+species+hybrids+for+gene+mapping+in+Xenopus.">Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus.</a> Nature. 279, 157-158 (1979).</li><li>Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+conservation+of+the+molecular+and+immunological+properties+of+the+chaperones+gp96+and+hsp70.">Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70.</a> Eur J Immunol. 31, 186-195 (2001).</li><li>Robert, J., Gantress, J., Cohen, N., Maniero, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+as+an+experimental+model+for+studying+evolution+of+hsp--immune+system+interactions.">Xenopus as an experimental model for studying evolution of hsp--immune system interactions.</a> Methods. 32, 42-53 (2004).</li><li>Chardonnens, X., Pasquier, D. u., L, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+skin+allograft+tolerance+during+metamorphosis+of+the+toad+Xenopus+laevis:+a+possible+model+for+studying+generation+of+self+tolerance+to+histocompatibility+antigens.">Induction of skin allograft tolerance during metamorphosis of the toad Xenopus laevis: a possible model for studying generation of self tolerance to histocompatibility antigens.</a> Eur J Immunol. 3, 569-573 (1973).</li><li>Du Pasquier, L., Bernard, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+suppression+of+the+allogeneic+histocompatibility+reactions+during+the+metamorphosis+of+the+clawed+toad+Xenopus.">Active suppression of the allogeneic histocompatibility reactions during the metamorphosis of the clawed toad Xenopus.</a> Differentiation. 16, 1-7 (1980).</li><li>Ramanayake, T., Simon, D. A., Frelinger, J. G., Lord, E. M., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+study+of+T-cell+responses+to+skin+alloantigens+in+Xenopus+using+a+novel+whole-mount+immunohistology+method.">In vivo study of T-cell responses to skin alloantigens in Xenopus using a novel whole-mount immunohistology method.</a> Transplantation. 83, 159-166 (2007).</li><li>Robert, J., Ramanayake, T., Maniero, G. D., Morales, H., Chida, A. S., S, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+conservation+of+glycoprotein+96+ability+to+interact+with+CD91+and+facilitate+antigen+cross-presentation.">Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation.</a> J Immunol. 180, 3176-3182 (2008).</li><li>Robert, J., Gantress, J., Rau, L., Bell, A., Cohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minor+histocompatibility+antigen-specific+MHC-restricted+CD8+T+cell+responses+elicited+by+heat+shock+proteins.">Minor histocompatibility antigen-specific MHC-restricted CD8 T cell responses elicited by heat shock proteins.</a> J Immunol. 168, 1697-1703 (2002).</li><li>Morales, H., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+techniques+for+comparative+study+of+antiviral+T-cell+responses+in+the+amphibian+Xenopus.">In vivo and in vitro techniques for comparative study of antiviral T-cell responses in the amphibian Xenopus.</a> Biol Proced Online. 10, 1-8 (2008).</li><li>Maniero, G. D., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+conservation+of+gp96-mediated+antigen-specific+cellular+immunity:+new+evidence+from+adoptive+cell+transfer+in+xenopus.">Phylogenetic conservation of gp96-mediated antigen-specific cellular immunity: new evidence from adoptive cell transfer in xenopus.</a> Transplantation. 78, 1415-1421 (2004).</li></ol>

Amfibi Xenopus bağışıklık çalışmak için benzersiz çok yönlü olmayan memeli modeli. Biyomedikal ve immünolojik araştırmalar yaygın kullanımı MHC tanımlanan klonlar LG-6 ve LG-15 gibi farklı hücre hatları ve monoklonal antikorlar gibi birçok önemli araştırma araçları vermiştir. Güçlü Ag-özel, küçük bir anti-H-Ag ve anti-tümör T hücre yanıtları 7 arabuluculuk gibi gp96 ısı şok proteinleri yeteneği çalışma in vitro ve in vivo deneylerde farklı kur...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Reagents needed:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl, 1.15 g/L </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Na2HPO4, 0.2 g/L </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KH2PO </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10N NaOH </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Crescent Research Chemicals </td>
<td>CAS#886-86-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium bicarbonate </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>S-233-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histopaque-1077</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>10771</td>
<td>100ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Heparin Sodium Salt </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich </td>
<td>H3149-50KU</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Iscove DMEM basal medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco-Invitrogen </td>
<td>11965</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kanamycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Primatone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sheffield Products Division</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;2-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHCO3 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30% double distilled water </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5% featal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25% of normal Xenopus serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Materials and Equipment:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>18 gauge 1&frac12; Precision Glide sterile needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml Slip Tip Syringe sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blades</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 cm glass petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>9" Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tygon tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Two # 5 Swiss Jeweler&#x2019;s Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltex Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios calipers </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High intensity illuminator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hemacytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Un-bunsen burner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>37&deg;C shaking incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

comparative in vivo study of gp96 adjuvanticity in the frog xenopus laevis

Amfibi Xenopus geliştirilen chaperoned antijenlerin çapraz sunum kolaylaştırmak ve doğal ve adaptif T hücre tepkiler. Xenopus deri grefti reddi gibi gp96 olarak belirli bir ısı şok proteinleri (HSP) yeteneği çalışma olmayan eşsiz bir memeli modeli laevis klasik MHC sınıf Ia (sınıf Ia) kısıtlı T hücre yanıtlarını ortaya çıkarmak için gp96 yeteneğini araştırmak için mükemmel bir platform sağlar. Ayrıca, Xenopus model sistem, böylece bağışıklık gözetim kaçan kendi sınıf Ia molekülleri aşağı düzenlenmiş tümörlere karşı tepkiler oluşturmak için gp96 yeteneği keşfetmek için farelere de cazip bir alternatif sağlar . Son zamanlarda, peritoneal lökosit antijen sunan hücreler (APC) olarak kullanarak Xenopus klonları bir evlatlık hücre transferi tahlil ve gösterdi ki küçük histokompatibilite cilt antijenlere karşı yanı sıra, Xenopus timik tümör 15 karşı in vivo gp96. Başbakan CD8 T hücre yanıtlarını sınıf Ia molekülleri ifade etmez / 0. Burada periton lökositlerin ortaya çıkarma, attığı evlatlık transferi, yanı sıra deri grefti ve tümör nakli deneyleri dahil olmak üzere bu testleri gerçekleştirmek için ilgili metodoloji açıklanmaktadır. Ayrıca biz de, periferik kan lökositleri akım sitometri ve cilt ret ve anti-tümör cevapların yer efektör nüfus daha fazla karakterizasyonu için izin proliferasyon deneyleri için kullanılan toplama ve ayırma nitelendiriyor.

Watch this Scientific Journal Video about Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis at JoVE.com

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

Kurbağa<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Antijen-spesifik CD8 T hücre yanıtları teşvik etmek gibi gp96 ısı şoku proteini yeteneği keşfetmek için cazip bir alternatif olmayan memeli modeli sağlar. Biz yöntemleri eğitim sunmak<em&gt; In vivo</em&gt; Gp96 tarafından cilt ve tümör antijenleri çapraz sunum kolaylaştırma.

Karşılaştırmalı In vivo</emKurbağa gp96 adjuvanlık> Eğitim Xenopus laevis</em

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to ...

comparative-vivo-study-gp96-adjuvanticity-frog-xenopus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

10.5K Görüntüleme.  University of Rochester. Kurbağa Xenopus laevis Antijen-spesifik CD8 T hücre yanıtları teşvik etmek gibi gp96 ısı şoku proteini yeteneği keşfetmek için cazip bir alternatif olmayan memeli modeli sağlar. Biz yöntemleri eğitim sunmak In vivo Gp96 tarafından cilt ve tümör antijenleri çapraz sunum kolaylaştırma.

Video: Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

Canlı bir Host Transgenik Leishmania Parazitlerinin in vivo Imaging

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In Vitro ve İn Vivo Modeli Gemi Duvar Altında Akış Koşulları Bakteriyel Yapışma Eğitim için

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

İnsan Plasental ve Desidual Organ Kültürleri Maternal-Fetal Arayüz de Enfeksiyonlar Eğitim için

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Eğitim için bir genetik Yaklaşım olarak yardımcı T hücrelerinin retroviral İletimi Mekanizmaları kendi Farklılaşma ve Kontrol Fonksiyonunun

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Mukozal astar sıvı noninvaziv örnekleme için In Vivo üst solunum yolu bağışıklık arabulucu düzeyleri miktar

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Patojenler, Commensals ve ana bilgisayar bağırsak epitel arasındaki etkileşimler çalışmaya insan Colonoid Monolayers

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

Tümör-spesifik CD8+ T hücre tepkiler Immunodominance çalışması Için In vivo sitotoksisite assays terzilik

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Karşılaştırmalı In vivo Eğitim Xenopus laevis