ティナマーティンとデビッドオルブライトが提供する専門の動物の飼育は感謝感謝です。この研究はNIHからの補助金T32 - AI - 07285（HN）、NIH R25 2GM064133（TCL）、1R03 - HD061671 - 01、R24 - AI - 059830〜06によってサポートされていました。

1。動物 X. laevisの X X.ジリハイブリッドLG - 6とLG - 15 isogeneticクローン1は、ロチェスター大学（http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm）で私たちの繁殖コロニーからです。 LG - 6とLG - 15株と同じヘテロ接合体MHCハプロタイプ（/ C）が、マイナー組織適合性（H）遺伝子座で異なります。これらのクローンからの子孫は、女性によって生成さ二倍体の卵は、UV照射精子（子孫にはDNAの貢献）によって活性化される、雌性発生によって生産されています。 手袋の使用は、通性です。一部の人々は、それがカエルを処理するより困難な（滑り）と実際にはカエルに不快感に表示されるので、それらを着用しないことを好む。 2。 15 / 0腫瘍（腫瘍およびH - AGSマイナーの両方を発現）からgp96の精製 Gp96精製は、以前は2、3を記載されている。簡単に言えば、gp96は錯那-セファロースとDEAEクロマトグラフィーを50〜70％硫安分画により精製される。タンパク質の約20〜50μgのは、腫瘍組織の1mlあたり得ることができます。準備の純度は​​SDS - PAGEとスライバー染色によって決定されます。 3。マイナーH - AG -異種LG - 6カエルから腹膜白血球（PLS）の誘発と収穫<ol><li> 25mLの一夜E.を拡大37 50 mLコニカルチューブの大腸菌培養°振とうC。 </li><li>次の日の熱は、1時間のためにそれを煮沸して細菌を殺す。 </li><li> E.を殺した熱を遠心4で2000回転（1,500 g）を℃で15分間大腸菌 </li><li>上清を除去し、1 / 10のapbsでオリジナルの培養液量（2.5 mL）に細菌ペレットを再懸濁します。この時点で細菌培養を使用する準備ができていると24時間以内に使用しなければなりません。 </li><li> 25ゲージ5月8日針を使用して、カエルあたりの加熱死菌製剤の腹腔内（ip）200（2インチカエルの場合）または300μLを（3インチカエルのための）注入。 </li><li>射出PLS 3日後、腹腔内洗浄によって回収されています。 </li><li> PLの収穫前に、大人のカエルはtricaineのメタンスルホン酸の0.1％水溶液（TMS、MS - 222）に浸漬して麻酔するすべての動きが停止するまで（時間は大きさや年齢によって異なります）までの5分間重炭酸ナトリウムで緩衝。動物は、治療後10〜20分以内に目覚める。 </li><li> 70％エタノールの量が少ないカエルの腹部を消毒する。 </li><li> 5mLの（2インチカエルの場合）または無菌のapbs 18ゲージ1 ½針を用いて腹腔内に室温で予め温めておいた10 mLの（3インチカエルのための）注入。針を外し、ゆっくりと注入されたバッファは、体腔内の流体との平衡化を保証するため分間カエルをマッサージ。 </li><li>きれいな50 mLコニカルチューブに針の背面から滴下される腹水を収集するための注射器なしで新しい18ゲージ1 ½針を使用してください。可能な限り初期の注入量をできるだけ多く取得することを確認してください。腹部の中央部に血管を避けるように注意してください。 </li><li>それはそれは、そのケージに戻って置くことができる、その時点で目を覚ましになるまで一度PLSは、浅い水を容器にカエルを入れて収穫されます。 </li></ol> 4。ナイーブのLg - 6受信者にLG - 6 PLSのパルスとの養子移入<ol><li>風邪のapbsで一度PLSを洗って、4℃で10分間、1,000 rpmで（750 g）で、それらを遠心</li><li>上清を取り除くとのapbsでPLSを懸濁します。 </li><li> 5 × 10 5 PLSあたり1μgのgp96の濃度でgp96とPLSをパルス。 </li><li> gp96の適切な量がPLSに追加されると、1時間氷上でペッティングし、インキュベートしてそれらを混ぜる。 </li><li>すべての非結合gp96を削除するには、4℃で10分間、1,000 rpmで℃で、1分間、14,000 rpmでどちらかの細胞を遠心分離します。 </li><li>残存gp96左がないことを確認するために冷たいのapbsと3X PLSを洗ってください。 </li><li> 300μLあたり5 × 10 5 PLSの濃度でパルスPLSを再懸濁します。 </li><li>養子25ゲージ5月8日針を用いて腹腔内注射でPLSを転送する。動物あたりのパルスPLS（5 × 10 5細胞）を300μLを注入する。 </li><li>カエルは、皮膚移植や腫瘍チャレンジ実験を続行する前に、少なくとも3日間プライミングする必要があります。 </li></ol> 5。皮膚移植アッセイ皮膚移植片の拒絶反応は、 アフリカツメガエル 4、5、6の十分に確立されたアッセイである。 アフリカツメガエルでは、受信者は21〜22時18から22日以内に1または2のMHCハプロタイプの不一致を表示するドナーの皮膚℃を拒否対照的に、LG - 6とマイナーH - AGSだけが異なるLG - 15のクローンとの間の皮膚移植は、（より30日その）よりゆっくりと拒否されます。しかし、この拒絶はレシピエントのthaで加速されるtは前の皮膚移植によってまたはドナーから精製gp96での免疫化のいずれかによってドナーマイナーH - AGSに対して準備されています。まったく拒絶反応（例えば、クローン化または完全に近交系動物）ドナーとレシピエントが遺伝的に同一である場合に発生しません。したがって、この単純な技法は、gp96によって誘発される生体の免疫応答に特徴づけるための非常に強力です。 <ol><li>として3.7で説明ドナーのカエルを麻酔。 注： アフリカツメガエルは、合計無菌処置の必要性がなくなります皮膚に強力な抗微生物ペプチド（例えば、マガイニン）生成するので、最低限の予防措置を取ることが必要。実際には、どんな消毒剤とカエルの治療は、肌に有害となる。さらに、 アフリカツメガエルは、人間に転送することができる任意の病原体を持っていない。そのため、手袋の使用はオプションです。しかし、使用されるすべての解剖器具はオートクレーブする必要があるとすべてのソリューションは、無菌である必要があります。 </li><li>はさみを使用してLG - 15ドナーのカエルから腹側皮膚の小（20㎜× 5mm）を片（原因irridophore色素細胞の存在に銀色に表示される腹部の皮膚）をカットして取り外します。 </li><li>ペトリ皿を含むのapbsで皮膚を配置し、その氷を見続ける。非常に穏やかに皮膚組織を操作し、鉗子の間でそれを保持していないように。 </li><li>カミソリやハサミを使用すると、5ミリメートルにするX 5mmの部分を個々の移植をカット。氷の上のapbsにフラグメントしてください。 </li><li>それは目覚めていると、それは抗生物質（5 mg / Lの濃度でPenstrep）を含む水中に置かれるまで、この時点で、ドナーのカエルは、浅い水でコンテナに配置されます。カエルは、それが通常の水に戻される時点で、二日間のための抗生物質で水に保持されます。皮膚が削除されたサイトで、小さな傷が縫い付けする必要があり、一週間以内に治癒していません。 </li><li>受信者のLG - 6カエルを麻酔。 </li><li>受信者の背側（背面）の皮膚に小さな切開を加えると、銀色の面を皮膚の下に5㎜× 5 mmの移植片を挿入する。これは変位あるいは移植片の損失につながる可能性があるため、皮膚の下に大きな気泡を導入しないように注意してください。 </li><li>スコアリングが開始されると、それらが移植片拒絶反応としてカウントされていないため、移植上のはさみや鉗子のマーキングに注意して確認してください。 </li><li> 24時間後にオーバーレイしてホストの皮膚の部分は移植片から除去する必要があります。 </li><li>受信者のLG - 6カエルを麻酔。 5.1で説明したように動物を扱う。 </li><li>移植片は自​​由に可視化できるようにオートクレーブはさみを使用すると、移植片の周囲に窓の外をカット。ドナーの皮膚に触れることや出血を誘発しないように注意してください。 5.5で説明したようにカエルが回復してみましょう。 </li><li>スケッチを取ってすぐに移植を得点起動します。皮膚移植片の拒絶は、移植皮膚上irridophoresの破壊の割合によって決定されます。 </li><li>移植片は2〜3日ごとにチェックする必要がありますが、動物は、このための麻酔である必要はありません。移植を可視化するために、カエルは解剖顕微鏡下でペトリ皿に配置する必要があります。 </li></ol> 6。移植皮膚のホールマウントの免疫組織カエルホールマウント免疫組織学は、以前は次の6を記載されている。簡単に言えば、カエル​​を麻酔し、カエルの水（作業領域も無菌的に調製される）とプリウェット滅菌ペーパータオルの上に顕微鏡の下に配置されます。移植皮膚は、その後、ホストの皮膚を周囲の少量と一緒に収穫され、それはフローサイトメトリー分析6の細胞の染色と同様に抗体で染色される。オートクレーブした楽器や滅菌緩衝液は使用する必要があります。皮膚を染色後、顕微鏡スライド上に配置され、静かにカバースリップを押す。この時点で、皮膚が移植片に侵入している別の細胞集団の蛍光顕微鏡を用いて可視化することができます。セクション5.5で説明したように手順の後、カエルは抗生物質で水の中に保持されます。と通常の水に戻った。皮膚が削除された場所、左の小さな傷は一週間以内に治癒する。 7。血白血球の特性評価<ol><li>カエルから血液を除去する前に、人は炎を介して滅菌パスツールピペットを引いて、&quot;ガラスの針を&quot;準備する必要があります。ピペットの微細な先端は、実体顕微鏡下で研ぎ澄まされている。ピペットは、吸引のプラスチックチューブに接続されています。 このような鉗子や鋏などのすべての楽器は使用前にオートクレーブ処理する必要があります。 </li><li>またのapbsの1mLあたりヘパリン50単位を追加してのapbsとヘパリン溶液の氷冷10 mLを準備する。氷の上で解決してください。使用されるすべてのソリューションは、無菌である必要があります。 </li><li> 3.7で説明したようにカエルを麻酔し、5.1で述べたのと同じ動物の取り扱い手順に従ってください。 。 </li><li>公開する後部足上記の皮膚をカット背側足根静脈。 </li><li>のapbs +ヘパリン溶液の1〜2 mLでパスツールピペットを埋める。 </li><li>静脈に&quot;ガラスの針&quot;を挿入し、ゆっくりと口で吸引し血液の収集を開始します。これが凝固し、針の先端を目詰まりから血液を防止するので、それは&quot;ガラスの針&quot;でのapbs +ヘパリン溶液を持つことが重要です。 </li><li>血液1〜2 mLのは、1つの平均的サイズのカエルから得ることができる。 </li><li>カエルの足の小さな切開は、縫い付けする必要はありませんし、傷は一週間以内に治癒する。 </li><li>で10分間4℃で1,000 rpmで血液を遠心</li><li>上清を除去し、コールドのapbsの10 mLの1X細胞を洗浄。 </li><li>フィコールHistopaque 1.077（シグマ）赤血球から血白血球を分離するために、室温で予め温めておいた1mLの上に血のオーバーレイを2mL（1〜5 × 10 6細胞）。 </li><li>ブレーキなしで、室温で1,000 rpmで20分を遠心し、白血球バンドを収集する。 </li><li> 4℃で10分間、1400 rpmで遠心分離でのapbsと2X細胞を洗浄° C残存フィコールを削除する。 </li><li>この時点で、細胞はフローサイトメトリー分析用の抗体で染色される準備ができている、またはin vitroでの培養アッセイのために使用される。 </li></ol> 8。腫瘍移植アッセイ<ol><li> 15 / 0、腫瘍細胞の新鮮​​なバッチから実験の雪解けの前に約一週間と細胞がよく成長し始めることを確認してください。培地は、簡潔に次のセクションでは、3で詳しく説明されています。 </li><li> 15 / 0腫瘍細胞を展開します。 </li><li>実験当日に、細胞をカウントし、トリパンブルー排除により、細胞死を決定する。細胞死は5％未満でなければなりません。 4℃で1,000 rpmで寒いのapbsの1X細胞、及び遠心分離を洗う℃で10分間。 </li><li> 300μLあたり5 × 10 5 15 / 0細胞の密度で腫瘍の培養培地で細胞を再懸濁します。 </li><li>動物の背側（背面）側の片側に25ゲージ5月8日針を用いて皮下注射することによりカエルあたり300μLボリュームで移植5 × 10 5細胞。 </li><li>腫瘍の成長は、腫瘍チャレンジ後2〜3週間以内に開始されます。初期の腫瘍の外観を注意して腫瘍体積は、2〜3日ごとに記録する必要がありますする必要があります。腫瘍体積は、（高さX長さX幅）カリパスを用いて測定されます。 </li><li>腫瘍は3,500 mm 3にして成長したり、カエルが無気力探し始めます、それは不快感を防ぐために安楽死する必要があります。いったん</li></ol> 9。試薬は必要なもの： <ul><li> 6.6グラム/ LのNaCl、1.15グラム/ LのNa 2 HPO 4、0.2 g / LのKH 2 PO：両生類のリン酸緩衝生理食塩水（のapbsを）バッファ。 10N NaOHおよびフィルタを用いてpH〜7.5は、0.2μmのフィルターを通して滅菌する。 </li><li> Tricaineメタンスルホネート（TMS、MS - 222）（クレセントリサーチケミカルズCAS＃886-86-2）。 </li><li>重炭酸ナトリウム（Fisher Scientific社のS - 233 - 500）。 </li><li> Histopaque - 1077（シグマ - アルドリッチ10771から100 mL）を</li><li>ヘパリンナトリウム塩（シグマアルドリッチH3149 - 50KU） </li><li> アフリカツメガエル 15 / 0腫瘍のための培地[詳細については、3を参照してください]：10mLのインスリン、10 mLの非必須アミノ酸、10 mLのペニシリン-ストレプトマイシンとイスコフDMEM基礎培地1 L（ギブコ-インビトロジェン11965）、10μgの/カナマイシン、primatone（シェフィールドの製品部門）、β2-メルカプトエタノールを1 mL、及び水に3.02グラムのNaHCO 3（pH7.0）を3mLの。この培地を30％再蒸留水を加えることによって両生類の浸透圧に希釈し、5％ウシ胎児血清、 アフリカツメガエルの腎臓の細胞株のA6から20％superantant、および通常のアフリカツメガエル血清の0.25％で補足される。 </li></ul> 10。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig1.jpg" alt="図1" /> 図1皮膚の移植片の拒絶12日移植後のStereomicroscopic分析。 LG - 6クローン化されたカエルは、（A）MHC -同一のLG - 6（ない拒絶反応を示していない）または（B）MHC -本質的に異なる近交系ドナー（80％除去）から皮膚移植を受けた。矢印は、健康的（非拒絶）移植された組織をマーキング銀色の虹色素胞色素細胞を示しています。 （*）のマークは、拒絶反応によるものでは鉗子。 <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 Gp96は、 アフリカツメガエルで腫瘍抗原のクロスプレゼンテーションを容易にします。LG - 15 PLSは、（5 × 10 5）のapbs（ネガティブコントロール）、E.から精製された組換えgp96の1μgのいずれかを氷上で1時間パルスしたgp96の大腸菌培養、または1または0.5μgのは、15 / 0の腫瘍組織から精製。 3回洗浄後、細胞を養子LG - 15大人の受信者（1 × 10 6 /個）に移した。三日後、だった15 / 0腫瘍細胞（5 × 10 5）住んでいる皮下注射で移植する。各曲線は一カエルの腫瘍増殖の動態を表します。腫瘍が最初に現れた日後のチャレンジを監視し、腫瘍サイズはキャリパー（長さ×幅×厚）で定期的に決定した。

<ol>
	<li>Kobel, H. R., Pasquier, D. u., L, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperdiploid+species+hybrids+for+gene+mapping+in+Xenopus.">Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus.</a> Nature. 279, 157-158 (1979).</li><li>Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+conservation+of+the+molecular+and+immunological+properties+of+the+chaperones+gp96+and+hsp70.">Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70.</a> Eur J Immunol. 31, 186-195 (2001).</li><li>Robert, J., Gantress, J., Cohen, N., Maniero, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+as+an+experimental+model+for+studying+evolution+of+hsp--immune+system+interactions.">Xenopus as an experimental model for studying evolution of hsp--immune system interactions.</a> Methods. 32, 42-53 (2004).</li><li>Chardonnens, X., Pasquier, D. u., L, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+skin+allograft+tolerance+during+metamorphosis+of+the+toad+Xenopus+laevis:+a+possible+model+for+studying+generation+of+self+tolerance+to+histocompatibility+antigens.">Induction of skin allograft tolerance during metamorphosis of the toad Xenopus laevis: a possible model for studying generation of self tolerance to histocompatibility antigens.</a> Eur J Immunol. 3, 569-573 (1973).</li><li>Du Pasquier, L., Bernard, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+suppression+of+the+allogeneic+histocompatibility+reactions+during+the+metamorphosis+of+the+clawed+toad+Xenopus.">Active suppression of the allogeneic histocompatibility reactions during the metamorphosis of the clawed toad Xenopus.</a> Differentiation. 16, 1-7 (1980).</li><li>Ramanayake, T., Simon, D. A., Frelinger, J. G., Lord, E. M., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+study+of+T-cell+responses+to+skin+alloantigens+in+Xenopus+using+a+novel+whole-mount+immunohistology+method.">In vivo study of T-cell responses to skin alloantigens in Xenopus using a novel whole-mount immunohistology method.</a> Transplantation. 83, 159-166 (2007).</li><li>Robert, J., Ramanayake, T., Maniero, G. D., Morales, H., Chida, A. S., S, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+conservation+of+glycoprotein+96+ability+to+interact+with+CD91+and+facilitate+antigen+cross-presentation.">Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation.</a> J Immunol. 180, 3176-3182 (2008).</li><li>Robert, J., Gantress, J., Rau, L., Bell, A., Cohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minor+histocompatibility+antigen-specific+MHC-restricted+CD8+T+cell+responses+elicited+by+heat+shock+proteins.">Minor histocompatibility antigen-specific MHC-restricted CD8 T cell responses elicited by heat shock proteins.</a> J Immunol. 168, 1697-1703 (2002).</li><li>Morales, H., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+techniques+for+comparative+study+of+antiviral+T-cell+responses+in+the+amphibian+Xenopus.">In vivo and in vitro techniques for comparative study of antiviral T-cell responses in the amphibian Xenopus.</a> Biol Proced Online. 10, 1-8 (2008).</li><li>Maniero, G. D., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+conservation+of+gp96-mediated+antigen-specific+cellular+immunity:+new+evidence+from+adoptive+cell+transfer+in+xenopus.">Phylogenetic conservation of gp96-mediated antigen-specific cellular immunity: new evidence from adoptive cell transfer in xenopus.</a> Transplantation. 78, 1415-1421 (2004).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

両生類のアフリカツメガエルは、免疫を研究するユニークな多用途の非哺乳類モデルです。生物医学と免疫学的研究におけるその広範な使用は、このようなMHC定義されているクローンLG - 6とLG - 15だけでなく、さまざまな細胞株とモノクローナル抗体などの多くの重要な研究ツールで得られている。我々は強力なのAg特異的抗マイナーH - Agおよび抗腫瘍T細胞応答7を仲介するよう...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Reagents needed:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl, 1.15 g/L </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Na2HPO4, 0.2 g/L </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KH2PO </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10N NaOH </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Crescent Research Chemicals </td>
<td>CAS#886-86-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium bicarbonate </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>S-233-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histopaque-1077</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>10771</td>
<td>100ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Heparin Sodium Salt </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich </td>
<td>H3149-50KU</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Iscove DMEM basal medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco-Invitrogen </td>
<td>11965</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kanamycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Primatone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sheffield Products Division</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;2-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHCO3 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30% double distilled water </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5% featal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25% of normal Xenopus serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Materials and Equipment:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>18 gauge 1&frac12; Precision Glide sterile needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml Slip Tip Syringe sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blades</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 cm glass petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>9" Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tygon tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Two # 5 Swiss Jeweler&#x2019;s Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltex Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios calipers </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High intensity illuminator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hemacytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Un-bunsen burner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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comparative in vivo study of gp96 adjuvanticity in the frog xenopus laevis

私たちは、両生類のアフリカツメガエルが chaperoned抗原のクロスプレゼンテーションを容易にし、自然免疫と獲得T細胞応答を誘発するようなgp96などの特定の熱ショックタンパク質（hsps）の能力を研究するために独自の非哺乳類モデルをアフリカツメガエル 。 ツメガエルの皮膚移植片の拒絶反応で開発している古典的MHCクラスIa（クラスⅠa）拘束性T細胞応答を惹起するgp96の能力を研究するための優れたプラットフォームを提供します。さらに、 アフリカツメガエルのモデルシステムはまた、それによって免疫監視を逃れるそれらのクラスIa分子をダウンレギュレートしている腫瘍に対して応答を生成するgp96の能力を探索するためのマウスに魅力的な代替手段を提供します。最近、我々は、抗原提示細胞（APC）として腹膜白血球を使用したアフリカツメガエルのクローンの養子セル転送アッセイを開発し、gp96が素数CD8 T細胞応答は、マイナー組織適合皮膚抗原に対するin vivoでだけでなく、 アフリカツメガエル胸腺の腫瘍15に対してできることが示されているクラスIa分子を発現していない/ 0。ここでは、腹膜白血球の誘発、パルスと養子移入だけでなく、皮膚移植と腫瘍移植アッセイを含むこれらのアッセイを行うために関係する方法論を説明します。さらに我々はまた、皮膚の拒絶反応と抗腫瘍応答に関与するエフェクター集団のさらなる特徴付けを可能にするフローサイトメトリーおよび増殖アッセイのために使用される末梢血白血球の収穫と分離して記述されています。

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Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

カエル<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;抗原特異的CD8 T細胞応答を促進するようなgp96などの熱ショック蛋白質の能力を探索するための魅力的な代替の非哺乳類モデルを提供します。私たちは、勉強する方法を提示<em&gt; in vivoで</emgp96による皮膚と腫瘍抗原のクロスプレゼンテーションの&gt;促進。

比較 in vivoで</emカエルのgp96アジュバント活性の>研究アフリカツメガエル</em

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

10.5K ビュー.  University of Rochester. カエルアフリカツメガエル抗原特異的CD8 T細胞応答を促進するようなgp96などの熱ショック蛋白質の能力を探索するための魅力的な代替の非哺乳類モデルを提供します。私たちは、勉強する方法を提示 in vivoで促進。

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In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

ライブホストのトランスジェニックリーシュマニア原虫のin vivoイメージング

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

免疫・感染学

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

白血球ホーミングと移行の非侵襲的イメージング in vivoで</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

新生児と大人の中枢神経系から培養ミクログリア

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

母体・胎児のインターフェイスでの感染症を研究するためにヒト胎盤および脱落膜器官培養

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

遺伝的分化を制御するメカニズムを研究するためのアプローチと機能などのヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

体内上部気道免疫メディエーター レベルの定量化のための粘膜内層流体の非侵襲的サンプリング

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウス リンパ球の定量化

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

病原体、共生生物、およびホストの腸上皮間の相互作用を研究する人間 Colonoid 単分子膜

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

腫瘍特異的 CD8+ T 細胞応答における Immunodominance を研究するためのインビボ細胞毒性アッセイ

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

比較 in vivoで研究アフリカツメガエル