Der Experte der Tierhaltung durch Tina Martin und David Albright vorgesehen ist, dankbar zu schätzen. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel T32-AI-07285 (HN), NIH R25 2GM064133 (TCL), 1R03-HD061671-01, R24-AI-059830-06 vom NIH gefördert.

1. Animals X. laevis x X. Gilli Hybriden LG-6 und LG-15 isogenetischen Klone 1 sind aus unserer Zucht Kolonie an der University of Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG-6 und LG-15 teilen sich die gleiche heterozygote MHC-Haplotyp (a / c) unterscheiden sich aber in Nebenhistokompatibilitätsantigene (H) loci. Progeny aus diesen Klonen von Gynogenese hergestellt, bei denen diploiden Eier vom Weibchen produziert von UV-bestrahlten Spermien (keine DNA Beitrag an die Nachkommen) aktiviert werden. Das Tragen von Handschuhen ist fakultativ. Einige Leute ziehen es nicht tragen, weil es schwieriger ist, die Frösche Griff (rutschig) und in der Tat scheint es, um die Frösche unbequem. 2. Reinigung von gp96 aus 15 / 0 Tumor (bekundet Beide Tumor-und Minor H-AGs) Gp96 Reinigung wurde bereits 2, 3 beschrieben. Kurz gesagt, ist gp96 um 50-70% Ammoniumsulfat-Fraktionierung, durch ConA-Sepharose und DEAE-Chromatographie gereinigt. Etwa 20-50 pg Protein kann pro 1 mL des Tumorgewebes erreicht werden. Reinheit des Präparates wird durch SDS-PAGE und Splitter-Färbung bestimmt. 3. Erhebung und Harvest of Peritoneal Leukozyten (PLS) von Minor H-Ag-disparate LG-6 Frogs <ol><li> Wachsen einer 25 ml Übernachtkultur E. Coli-Kultur in einer 50 ml konischen Rohr bei 37 ° C unter Schütteln. </li><li> Am nächsten Tag Hitze tötet die Bakterien durch Kochen für 1 Stunde. </li><li> Centrifuge die Hitze getötet E. Coli für 15 min bei 2.000 rpm (1.500 g) bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Bakterienpellet in 1 / 10 th der ursprünglichen Kultur Volumen (2,5 ml) in APBS. An diesem Punkt der Bakterienkultur ist gebrauchsfertig und muss innerhalb von 24 Stunden verwendet werden. </li><li> Inject intraperitoneal (ip) 200 (für ein 2-Zoll-Frosch) oder 300 ul (für ein 3-Zoll-Frosch) der durch Hitze abgetöteten Bakterien Vorbereitung pro Frosch mit einer 25-Gauge-5 / 8 Nadel. </li><li> Drei Tage nach der Injektion PLs werden durch intraperitoneale Lavage geerntet. </li><li> Vor PL Ernte, sind erwachsene Frösche betäubt durch Eintauchen in eine 0,1% ige wässrige Lösung von Tricaine Methansulfonat (TMS, MS-222) mit Natriumbicarbonat für bis zu 5 min zwischengespeichert werden, bis alle Bewegungen aufhört (Dauer hängt von Größe und Alter). Tiere erwachen innerhalb von 10-20 min nach der Behandlung. </li><li> Desinfizieren Sie den Bauch des Frosches mit einer kleinen Menge von 70% Ethanol. </li><li> Inject 5 mL (bei einem 2-Zoll-Frosch) oder 10 ml (für einen 3-Zoll-Frosch) von sterilen APBS bei Raumtemperatur in die Bauchhöhle mit einer 18-Gauge-Nadel 1 ½ vorgewärmt. Entfernen Sie die Nadel und sanft einmassieren der Frosch für eine Minute, um sicherzustellen, dass das injizierte Puffer mit der Flüssigkeit in die Körperhöhle ausgleicht. </li><li> Verwenden Sie eine neue 18-Gauge-Nadel 1 ½ ohne eine Spritze, die Peritonealflüssigkeit, dass von der Rückseite der Nadel in einem sauberen 50 mL konischen Rohr tropft sammeln. Achten Sie darauf, wie viel von der ursprünglichen injizierte Volumen wie möglich zu erhalten. Achten Sie darauf, die Blutgefäße im zentralen Bereich der Bauchregion zu vermeiden. </li><li> Sobald PLs geerntet setzen den Frosch in einen Behälter mit flachem Wasser, bis er wach ist, an welcher Stelle es zurück in seinen Käfig gelegt werden. </li></ol> 4. Pulsing und adoptiven Transfer von Lg-6 Pls in naive Lg-6 Empfänger <ol><li> Waschen Sie die PLs einmal mit kaltem APBS und Zentrifuge sie bei 1.000 rpm (750 g) für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das PLs in APBS. </li><li> Pulse des PLS mit gp96 bei einer Konzentration von 1 ug gp96 pro 5 x 10 5 PLS. </li><li> Sobald der entsprechende Betrag von gp96 an das PLS hinzugefügt wird, mischen sie durch Pipettieren und auf Eis inkubieren für 1 Stunde. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen entweder bei 1.000 rpm für 10 min bei 4 ° C oder bei 14.000 rpm für 1 min, um alle ungebundenen gp96 zu entfernen. </li><li> Waschen Sie die PLs 3X mit kaltem APBS, um sicherzustellen, gibt es keinen Rest-gp96 links. </li><li> Resuspendieren der gepulsten PLs bei einer Konzentration von 5 x 10 5 PLs pro 300 ul. </li><li> Adoptiv Transfer PLs durch ip-Injektion mit 25-Gauge-5 / 8 Nadel. Inject 300 ul gepulsten PLs (5 x 10 5 Zellen) pro Tier. </li><li> Frösche müssen grundiert mindestens 3 Tage, bevor Sie mit Hauttransplantation oder Tumor Herausforderung Experimente. </li></ol> 5. Skin Graft Assay Haut-Transplantat-Abstoßung ist eine gut etablierte Assay in Xenopus 4, 5, 6. In Xenopus, lehnt einen Empfänger Spenderhaut Anzeige 1 oder 2 MHC Haplotyp Fehlanpassungen innerhalb 18-22 Tage bei 21-22 ° C. Im Gegensatz dazu sind Hauttransplantationen zwischen LG-6 und LG-15-Klone, die sich nur durch kleinere H-Ags langsamer (mehr als 30 Tage) abgelehnt. Allerdings ist diese Ablehnung in Empfängern tha beschleunigtt gegen Spender kleinere H-Ags entweder durch eine frühere Hauttransplantation oder durch Immunisierung mit gp96 vom Spender gereinigt grundiert. Keine Ablehnung überhaupt auftritt, wenn der Spender und Empfänger genetisch identisch (z. B., geklont oder vollständig Inzucht Tiere) sind. Daher ist diese einfache Technik sehr mächtig zur Charakterisierung in vivo Immunantwort, die durch gp96. <ol><li> Anesthetize Spender Frosch als in 3.7 beschrieben. Hinweis: Nur minimale Vorsichtsmaßnahmen ergriffen werden müssen, da Xenopus potente antimikrobielle Peptide (zB Magainin) produzieren in der Haut, die die Notwendigkeit für die gesamte aseptischen Verfahren vermeidet. In der Tat würde die Behandlung des Frosches mit einem Desinfektionsmittel schädlich sein für die Haut. Hinzu kommt, dass Xenopus keine Krankheitserreger, die auf den Menschen übertragen werden können. Daher ist die Verwendung von Handschuhen optional. Allerdings müssen alle die Präparation verwendeten Instrumente sterilisiert werden und alle Lösungen müssen steril sein. </li><li> Ausschneiden und Entfernen eines kleinen (20 mm X 5 mm) Stück Bauchhaut (Bauchhaut, die silbrig durch das Vorhandensein von irridophore pigmentierten Zellen erscheint) aus einem LG-15 Spender Frosch mit einer Schere. </li><li> Legen Sie die Haut in einer Petrischale mit APBS und bewahren Sie es auf Eis. Bearbeiten Sie die Hautgewebe sehr sanft; vermeiden halten es zwischen Zange. </li><li> Mit einer Rasierklinge oder einer Schere geschnitten einzelnen Transplantate in 5 mm X 5 mm Stücke. Halten Sie die Fragmente in APBS auf Eis. </li><li> An diesem Punkt des Spenders Frosch wird in einem Behälter mit flachem Wasser gelegt, bis es wach und dann ist es in Wasser mit Antibiotika (Penstrep bei einer Konzentration von 5 mg / L) gelegt wird. Der Frosch wird in Wasser mit Antibiotika für zwei Tage, an welcher Stelle es in normales Wasser zurück gehalten. Die kleine Wunde an der Stelle, wo die Haut entfernt wurde muss nicht genäht werden und heilt innerhalb einer Woche. </li><li> Anesthetize der Empfänger LG-6 Frosch. </li><li> Machen Sie einen kleinen Einschnitt auf der dorsalen (hinteren) Haut des Empfängers ein und legen Sie die 5 mm X 5 mm Transplantat unter der Haut mit der silbernen Seite nach oben. Achten Sie darauf, große Luftblasen unter der Haut führen, weil das gegen Verschiebung oder sogar zum Verlust des Transplantats führen kann. </li><li> Stellen Sie sicher, beachten Sie die Schere und Pinzette Markierungen auf der Transplantate, weil diese nicht als Transplantat-Abstoßung gezählt werden, wenn die Scoring beginnt. </li><li> 24 Stunden später ein Teil der Überlagerung Host Haut braucht, um aus dem Transplantat entfernt werden. </li><li> Anesthetize der Empfänger LG-6 Frosch. Behandeln Sie das Tier wie unter 5.1 beschrieben. </li><li> Mit autoklaviert Schere schneiden Sie ein Fenster um das Transplantat so dass das Transplantat kann frei visualisiert. Achten Sie darauf, den Spender Haut berühren oder zu Blutungen zu induzieren. Lassen Sie den Frosch wieder wie in 5.5 beschrieben. </li><li> Starten Scoring das Transplantat sofort, indem sie eine Skizze. Haut-Transplantat-Abstoßung wird durch den Prozentsatz der Zerstörung der irridophores auf der transplantierten Haut bestimmt. </li><li> Die Transplantate müssen überprüft alle 2-3 Tage, aber die Tiere müssen nicht betäubt werden für diese. Zur Visualisierung der Transplantate, müssen die Frösche in einer Petrischale unter einem Binokular platziert werden. </li></ol> 6. Whole-mount Immunhistologie von transplantierten Haut Frog ganzen-mount Immunhistologie wurde bereits 6 beschrieben. Kurz gesagt, ist der Frosch betäubt und unter dem Mikroskop auf einem sterilen Papiertuch vornässen mit Frosch Wasser (Arbeitsbereich ist auch aseptisch vorbereitet). Das transplantierte Haut wird dann zusammen mit einer kleinen Menge der umgebenden Haut Host geerntet und es ist mit Antikörpern ähnlich Zellfärbung für die Durchflusszytometrie Analyse 6. gefärbt. Autoklaviert Instrumente und sterile Puffer verwendet werden müssen. Nach der Färbung der Haut befindet sich auf einem Objektträger gebracht und vorsichtig mit einem Deckglas gedrückt. An diesem Punkt kann die Haut sichtbar gemacht werden mit einem Fluoreszenz-Mikroskop für unterschiedliche Zellpopulationen, dass das Transplantat infiltriert haben. Nach dem Eingriff der Frosch wird in Wasser mit Antibiotika gehalten, wie in Abschnitt 5.5 beschrieben. und in normalem Wasser zurückgegeben. Die kleine Wunde links, wo die Haut wurde entfernt heilt innerhalb einer Woche. 7. Charakterisierung von Leukozyten <ol><li> Bevor Sie das Blut aus der Frosch, muss man &quot;Glasnadeln&quot;, indem sterile Pasteur Pipetten über Flamme vorzubereiten. Die feine Spitze der Pipette wird unter dem Stereomikroskop geschärft. Die Pipette wird dann zu einer Aspiration Kunststoffschlauch verbunden. Alle Instrumente wie Zangen und Scheren müssen vor dem Einsatz autoklaviert werden. </li><li> Auch vorzubereiten eiskalter 10 ml APBS und Heparin-Lösung durch Zugabe von 50 Einheiten Heparin pro 1 ml APBS. Keep-Lösung auf Eis. Alle verwendeten Lösungen müssen steril sein. </li><li> Anesthetize Frosch als in 3.7 beschrieben, und folgen Sie dem gleichen Tier Handhabung wie in 5.1 beschrieben. . </li><li> Schneiden Sie die Haut über dem hinteren Fuß zu setzender dorsalen Tarsus Vene. </li><li> Füllen Sie die Pasteurpipette mit 1-2 ml APBS + Heparin-Lösung. </li><li> Legen Sie die &quot;gläserne Nadel&quot; in die Vene und sammeln das Blut durch langsames Ansaugen mit dem Mund. Es ist wichtig, APBS + Heparin-Lösung in die &quot;gläserne Nadel&quot; haben, da diese die Blutgerinnung und das Verstopfen der Spitze der Nadel zu verhindern. </li><li> 1 bis 2 ml Blut kann von einer durchschnittlich großen Frosch erreicht werden. </li><li> Die kleinen Schnitt am Froschschenkel muss nicht genäht werden und die Wunde heilt innerhalb einer Woche. </li><li> Zentrifuge das Blut bei 1.000 rpm für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und die Zellen 1x mit 10 ml kaltem APBS. </li><li> Overlay 2 ml Blut (1-5 x 10 6 Zellen) auf 1 ml Ficoll Histopaque 1,077 (Sigma) bei Raumtemperatur vorgewärmt, um das Blut Leukozyten aus den roten Blutkörperchen zu trennen. </li><li> Zentrifuge 20 min bei 1.000 rpm bei Raumtemperatur ohne Bremse, und dann sammeln die Leukozyten-Band. </li><li> Waschen Sie die Zellen 2X mit APBS durch Zentrifugation bei 1.400 rpm für 10 min bei 4 ° C zur Entfernung des Rest-Ficoll. </li><li> An dieser Stelle werden die Zellen bereit, mit Antikörpern für die Durchflusszytometrie-Analyse gefärbt werden, zu nutzen oder für in-vitro-Kultur-Assays werden. </li></ol> 8. Tumor Transplantation Assay <ol><li> Etwa eine Woche vor dem Experiment auftauen eine neue Charge von 15 / 0 Tumorzellen und stellen Sie sicher, dass die Zellen gut wachsen beginnen. Kulturmedium ist kurz und bündig in den nächsten Abschnitt und im Detail in 3 beschrieben. </li><li> Erweitern Sie die 15 / 0 Tumorzellen. </li><li> Am Tag des Experiments, zählen Sie die Zellen und bestimmen Zelltod durch Trypanblau-Ausschluss. Tote Zellen weniger als 5% betragen. Wash-Zellen 1X in kalten APBS und Zentrifuge bei 1.000 rpm bei 4 ° C für 10 min. </li><li> Resuspendieren der Zellen in Tumorzellen Kulturmedium in einer Dichte von 5 x 10 5 15 / 0 Zellen pro 300 ul. </li><li> Transplant 5 x 10 5 Zellen in 300 ul Volumen pro Frosch durch subkutane Injektion mit einer 25-Gauge-5 / 8 Nadel auf einer Seite des dorsalen (hinteren) Seite des Tieres. </li><li> Das Tumorwachstum wird innerhalb von 2-3 Wochen nach der Tumor-Challenge zu starten. Die ursprünglichen Tumor Aussehen zu beachten und das Tumorvolumen muss erfasst alle 2-3 Tage. Tumorvolumen (Höhe x Länge x Breite) wird unter Verwendung von Bremssätteln. </li><li> Sobald der Tumor wächst auf 3.500 mm 3 oder der Frosch beginnt mit der Suche lethargisch, muss er eingeschläfert werden, um Beschwerden zu vermeiden. </li></ol> 9. Benötigten Reagenzien: <ul><li> Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): 6,6 g / L NaCl, 1,15 g / L Na 2 HPO 4, 0,2 g / L KH 2 PO. pH auf 7,5 mit 10N NaOH und filtriert durch 0,2 um-Filter sterilisiert. </li><li> Tricaine Methansulfonat (TMS, MS-222) (Crescent Research Chemicals CAS # 886-86-2). </li><li> Natriumbicarbonat (Fisher Scientific S-233 bis 500). </li><li> Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich 10771-100 ml) </li><li> Heparin Sodium Salt (Sigma-Aldrich H3149-50KU) </li><li> Kulturmedium für Xenopus 15 / 0 Tumoren [siehe 3 für weitere details]: 1 L Iscove DMEM Basalmedium (Gibco-Invitrogen 11965) mit 10 ml Insulin, 10 ml nicht-essentiellen Aminosäuren, 10 ml Penicillin-Streptomycin; 10 ug / ml Kanamycin, 3 ml Primatone (Sheffield Products Division), 1 ml der β2-Mercaptoethanol und 3,02 g NaHCO 3 in Wasser (pH 7,0). Dieses Medium ist, um Amphibien Osmolarität durch Zugabe von 30% doppelt destilliertem Wasser verdünnt, und ergänzt mit 5% fötalem Rinderserum, 20% superantant aus einer Xenopus Nierenzellinie A6 und 0,25% der normalen Xenopus Serum. </li></ul> 10. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Stereomikroskopische Analyse der Haut Abstoßung 12 Tage nach der Transplantation. LG-6 geklont Frosch erhielt eine Hauttransplantation entweder (A) eine MHC-identischen LG-6 (zeigt keine Ablehnung) oder (B) eine MHC-disparate outbred Spender (80% Ablehnung). Arrows zeigt silbrige iridophore pigmentierten Zellen Kennzeichnung gesunde (nicht abgelehnt) veredelt Gewebe. (*) Mark der Zange nicht auf Ablehnung. <img src="/files/ftp_upload/2026/2026fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Gp96 erleichtert Cross-Präsentation von Tumor-Antigenen in Xenopus. LG-15 PL (5 x 10 5) wurden für 1 Stunde auf Eis entweder mit APBS (negative Kontrolle), 1 ug von rekombinanten gp96 aus einem E. gereinigt gepulsten Coli-Kultur, oder 1 oder 0,5 ug gp96 aus 15 / 0 Tumorgewebe gereinigt. Nach 3 Waschungen wurden die Zellen adoptiv in LG-15 erwachsene Empfänger übertragen (1 x 10 6 / Person). Drei Tage später, leben 15 / 0 Tumorzellen (5 x 10 5) wurdentransplantiert durch sc Injektion. Jede Kurve stellt die Kinetik des Tumorwachstums in einen Frosch. Tage nach der Belastung, wenn Tumoren erschien erstmals überwacht wurden, und die Tumorgröße wurde regelmäßig mit einem Bremssattel (Länge x Breite x Dicke) ermittelt.

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	<li>Kobel, H. R., Pasquier, D. u., L, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperdiploid+species+hybrids+for+gene+mapping+in+Xenopus.">Hyperdiploid species hybrids for gene mapping in Xenopus.</a> Nature. 279, 157-158 (1979).</li><li>Robert, J., Menoret, A., Basu, S., Cohen, N., Srivastava, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+conservation+of+the+molecular+and+immunological+properties+of+the+chaperones+gp96+and+hsp70.">Phylogenetic conservation of the molecular and immunological properties of the chaperones gp96 and hsp70.</a> Eur J Immunol. 31, 186-195 (2001).</li><li>Robert, J., Gantress, J., Cohen, N., Maniero, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+as+an+experimental+model+for+studying+evolution+of+hsp--immune+system+interactions.">Xenopus as an experimental model for studying evolution of hsp--immune system interactions.</a> Methods. 32, 42-53 (2004).</li><li>Chardonnens, X., Pasquier, D. u., L, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+skin+allograft+tolerance+during+metamorphosis+of+the+toad+Xenopus+laevis:+a+possible+model+for+studying+generation+of+self+tolerance+to+histocompatibility+antigens.">Induction of skin allograft tolerance during metamorphosis of the toad Xenopus laevis: a possible model for studying generation of self tolerance to histocompatibility antigens.</a> Eur J Immunol. 3, 569-573 (1973).</li><li>Du Pasquier, L., Bernard, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+suppression+of+the+allogeneic+histocompatibility+reactions+during+the+metamorphosis+of+the+clawed+toad+Xenopus.">Active suppression of the allogeneic histocompatibility reactions during the metamorphosis of the clawed toad Xenopus.</a> Differentiation. 16, 1-7 (1980).</li><li>Ramanayake, T., Simon, D. A., Frelinger, J. G., Lord, E. M., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+study+of+T-cell+responses+to+skin+alloantigens+in+Xenopus+using+a+novel+whole-mount+immunohistology+method.">In vivo study of T-cell responses to skin alloantigens in Xenopus using a novel whole-mount immunohistology method.</a> Transplantation. 83, 159-166 (2007).</li><li>Robert, J., Ramanayake, T., Maniero, G. D., Morales, H., Chida, A. S., S, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+conservation+of+glycoprotein+96+ability+to+interact+with+CD91+and+facilitate+antigen+cross-presentation.">Phylogenetic conservation of glycoprotein 96 ability to interact with CD91 and facilitate antigen cross-presentation.</a> J Immunol. 180, 3176-3182 (2008).</li><li>Robert, J., Gantress, J., Rau, L., Bell, A., Cohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minor+histocompatibility+antigen-specific+MHC-restricted+CD8+T+cell+responses+elicited+by+heat+shock+proteins.">Minor histocompatibility antigen-specific MHC-restricted CD8 T cell responses elicited by heat shock proteins.</a> J Immunol. 168, 1697-1703 (2002).</li><li>Morales, H., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+techniques+for+comparative+study+of+antiviral+T-cell+responses+in+the+amphibian+Xenopus.">In vivo and in vitro techniques for comparative study of antiviral T-cell responses in the amphibian Xenopus.</a> Biol Proced Online. 10, 1-8 (2008).</li><li>Maniero, G. D., Robert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+conservation+of+gp96-mediated+antigen-specific+cellular+immunity:+new+evidence+from+adoptive+cell+transfer+in+xenopus.">Phylogenetic conservation of gp96-mediated antigen-specific cellular immunity: new evidence from adoptive cell transfer in xenopus.</a> Transplantation. 78, 1415-1421 (2004).</li></ol>

Die Amphibien Xenopus ist eine einzigartige vielseitige Nicht-Säuger-Modell, um Immunität zu studieren. Seine umfangreichen Einsatz in der biomedizinischen und immunologischen Forschung hat in vielen wichtigen Forschungs-Tools wie der MHC definierten Klone LG-6 und LG-15 sowie verschiedene Zelllinien und monoklonalen Antikörpern ergab. Mit Hilfe dieser Werkzeuge, die wir gegründet haben verschiedene in vitro und in vivo-Tests, die Fähigkeit der Hitzeschock-Proteine ​​wie gp96 potente ...

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<td>Reagents needed:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>Amphibian Phosphate Buffered Saline (APBS): </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>NaCl, 1.15 g/L </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Na2HPO4, 0.2 g/L </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>KH2PO </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>10N NaOH </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricaine Methane Sulfonate (TMS, MS-222) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Crescent Research Chemicals </td>
<td>CAS#886-86-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium bicarbonate </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>S-233-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Histopaque-1077</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>10771</td>
<td>100ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Heparin Sodium Salt </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich </td>
<td>H3149-50KU</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Culture medium for Xenopus 15/0 tumors [see 3 for more details]:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Iscove DMEM basal medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco-Invitrogen </td>
<td>11965</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insulin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>Penicillin-streptomycin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>Kanamycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>Primatone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sheffield Products Division</td>
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<td>&nbsp;</td>
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<td>&beta;2-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>NaHCO3 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30% double distilled water </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>5% featal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20% superantant from a Xenopus kidney cell line A6 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25% of normal Xenopus serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>Materials and Equipment:</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>&nbsp;</td>
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<td>50 and 15 ml conical centrifuge tubes (sterile)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25 gauge 5/8 Precision Glide sterile needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>18 gauge 1&frac12; Precision Glide sterile needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml Tuberculin Slip Tip Syringe sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>10 ml Slip Tip Syringe sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 ml MicroCentrifuge tubes (sterile)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>60 X 15 mm Polystyrene Petri Dishes sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>Razor blades</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>25 X 75 mm X 1 mm Premium Microscope Slides </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 cm glass petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>9" Pasteur Pipetes Durex Borosilicate Glass Cotton Plugged Disposable</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tygon tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Two # 5 Swiss Jeweler&#x2019;s Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltex Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Dissecting Spring Scissors McPherson-Vannas straight cutting edge 6 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios calipers </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>High intensity illuminator</td>
<td>&nbsp;</td>
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comparative in vivo study of gp96 adjuvanticity in the frog xenopus laevis

Wir haben in den Amphibien Xenopus laevis entwickelt eine einzigartige Nicht-Säuger-Modell, um die Fähigkeit bestimmter Hitzeschockproteine ​​(HSP), wie gp96, um Cross-Präsentation von Antigenen beaufsichtigt zu erleichtern und zu entlocken angeborenen und erworbenen T-Zell-Antworten. Xenopus Haut Abstoßungsreaktion Studie bietet eine hervorragende Plattform, um die Fähigkeit des gp96 zu den klassischen MHC-Klasse-Ia (Klasse Ia) eingeschränkte T-Zell-Reaktionen zu entlocken zu studieren. Darüber hinaus die Xenopus-Modell-System bietet auch eine attraktive Alternative zu Mäusen für die Erkundung der Möglichkeit von gp96 zu Reaktionen gegen Tumore, die haben ihre Klasse Ia-Moleküle herunter reguliert dadurch entkommen Immunüberwachung generieren. Kürzlich haben wir ein Adoptiv-Zell-Transfer-Assay in Xenopus-Klone mit peritonealen Leukozyten Antigen-präsentierende Zellen (APC) entwickelt und gezeigt, dass gp96 kann prime CD8 T-Zell-Antworten in vivo gegen Nebenhistokompatibilitätsantigene Haut-Antigene als auch gegen die Xenopus Thymus Tumor 15 / 0, die nicht zum Ausdruck bringt Klasse Ia-Moleküle. Wir beschreiben hier die Methodik einbezogen, um diese Tests, einschließlich der Erhebung, pulsierende und adoptiven Transfer von peritonealen Leukozyten, sowie die Hauttransplantation und Tumortransplantation Assays durchzuführen. Darüber hinaus sind wir auch beschreiben, die Ernte und die Trennung von peripheren Blut Leukozyten für die Durchflusszytometrie und Proliferation Assays, die zur weiteren Charakterisierung der Effektor-Populationen in der Haut Ablehnung und Anti-Tumor-Reaktionen beteiligt ermöglichen eingesetzt.

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Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

Der Frosch<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Bietet eine attraktive Alternative Nicht-Säuger-Modell für die Erkundung der Fähigkeit des Hitzeschock-Proteins, wie gp96, Antigen-spezifische CD8 T-Zell-Reaktionen zu fördern. Wir präsentieren Methoden zur Untersuchung<em&gt; In vivo</em&gt; Erleichterung der Cross-Präsentation von Haut-und Tumor-Antigene von gp96.

Vergleichende In vivo Studium der gp96 Adjuvantizität in the Frog Xenopus laevis</em

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to ...

comparative-vivo-study-gp96-adjuvanticity-frog-xenopus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

10.5K Aufrufe.  University of Rochester. Der Frosch Xenopus laevis Bietet eine attraktive Alternative Nicht-Säuger-Modell für die Erkundung der Fähigkeit des Hitzeschock-Proteins, wie gp96, Antigen-spezifische CD8 T-Zell-Reaktionen zu fördern. Wir präsentieren Methoden zur Untersuchung In vivo Erleichterung der Cross-Präsentation von Haut-und Tumor-Antigene von gp96.

Serie: Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

In-vivo-Imaging von transgenen Leishmania Parasiten in einer Live-Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of lesion size is a hard procedure and animals show difficulty to eat, breathe and move because of the lesion. In order to optimize the hamster model for cutaneous leishmaniasis, young adult male and female golden hamsters (Mesocricetus auratus) were injected intradermally at the dorsal skin with 1 to 1.5 x l07 promastigotes of Leishmania species and progression of subsequent lesions were evaluated for up to 16 weeks post infection. The golden hamster was selected because it is considered the adequate bio-model to evaluate drugs against Leishmania as they are susceptible to infection by different species. Cutaneous infection of hamsters results in chronic but controlled lesions, and a clinical evolution with signs similar to those observed in humans. Therefore, the establishment of the extent of infection by measuring the size of the lesion according to the area of indurations and ulcers is feasible. This approach has proven its versatility and easy management during inoculation, follow up and characterization of typical lesions (ulcers), application of treatments through different ways and obtaining of clinical samples after different treatments. By using this method the quality of animal life regarding locomotion, search for food and water, play and social activities is also preserved.

Optimization of the experimental hamster model for cutaneous leishmaniasis by intradermal injection of Leishmania promastigotes at the dorsal skin. This approach is useful during inoculation, follow-up, characterization of lesions, application of treatments and obtaining of clinical samples. Locomotion, search for food and water, play and social activities are preserved.

Kutane Leishmaniose in der Rückenhaut von Hamstern: ein nützliches Modell für das Screening von Drogen leishmanientötende

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Menschliche Plazenta und Deziduale Organkulturen Infektionen zu studieren an der Maternal-fetale Schnittstelle

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Retrovirale Transduktion von T-Helferzellen als genetischer Ansatz zur Untersuchung Mechanismen der Kontrolle ihrer Differenzierung und Funktion

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Nicht-invasive Probenahme von Schleimhaut-Flüssigkeit für die Quantifizierung von In Vivo oberen Atemwegen immun-Mediator-Level

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

Quantifizierung der menschliche Monocyte Chemotaxis In Vitro und murinen Lymphozyten Menschenhandel In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Menschliche Colonoid Monolagen Wechselwirkungen zwischen Erreger, Kommensalen und Host Darmepithel zu studieren

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...