Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche global du California Institute for Regenerative Medicine (RC1-00104), un Service de santé publique de subvention (HL085377) à partir du NHLBI, et un don de la Fondation Pollin à HSB

Le protocole écrit ci-dessous est basée sur des paramètres publiés par les auteurs, avec quelques modifications. Le protocole est exécuté avec l&#39;approbation par le soin des animaux UCSF institutionnels et d&#39;utilisation (IACUC) et surveillance de la recherche sur les cellules souches (SCRO) Comités. I. Culture des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) <ol><li> Cultivez CSEh en standard à 6 puits (3,5 cm de diamètre des puits) plaques. </li><li> Au moins 12 heures avant repiquage des cellules, fibroblastes de souris graines embryonnaires (MEF; obtenu à partir de CF1 jour E12.5 souris chronométrés-estimé, irradiés à 1000 Ci) cellules nourricières sur des plaques enduites de gélatine à 1% (6,7). FAE devrait être plaqué à 50-60% de confluence, ou 4 x 10 5 cellules par 3,5 cm de diamètre ainsi (figure 1). </li><li> Passage des cellules où les colonies ont atteint la confluence ~ 70% (figure 2). </li><li> Pour le passage des cellules, la croissance moyenne aspirer KSR (6) dans les puits et les remplacer par 0,5 ml de milieu contenant de la collagénase IV dans KSR à une concentration de 1 mg / ml. </li><li> Incuber les plaques avec de la collagénase IV à 37 ° C / 5% CO 2 pendant 5 minutes ou jusqu&#39;à ce que les bords des colonies commencent à soulever de la plaque. </li><li> Retirez la collagénase IV de la plaque, ajoutez 0,5 ml de KSR dans chaque puits, et manuellement gratter les cellules à supprimer complètement de la plaque. </li><li> Recueillir la suspension de cellules de chaque puits, placer dans un tube de 15 ml conique, et permettent aux cellules de se déposent par gravité pendant 5 minutes. </li><li> Retirer le surnageant du tube, laissant les cellules et le milieu dans un volume total de ~ 300μl. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un micro-200 pl pipeteur fixé à plein volume, délicatement la pipette la suspension de cellules 5-6 fois pour briser les colonies. </li><li> Apportez la suspension cellulaire à un volume total de 9 ml par puits original de cellules en utilisant un milieu KSR (c&#39;est à dire, si l&#39;on est bien récolté, le tube doit contenir 9 ml). Supplément de la moyenne avec facteur humain recombinant fibroblastes de croissance basique (bFGF) à une concentration de 12,5 ng / ml. </li><li> Après lavage des puits nouveaux contenant des cellules MEF (voir étape 2) avec du phosphate de Dulbecco saline tamponnée (DPBS) pour supprimer tous sérum, ajouter 3 ml de la suspension cellulaire dans chaque puits et incuber les plaques à 37 ° C CO / 5% 2. </li><li> Changer moyennes KSR avec bFGF 24 heures après le passage, et toutes les 24-48 heures jusqu&#39;à cellules sont prêtes à être repiquées à nouveau. </li></ol> II. Préparation des CSEh granulés pour le greffage <ol><li> A 24 heures avant la greffe, ajouter l&#39;inhibiteur ROCK au milieu KSR à une concentration finale de 10 uM d&#39;augmenter la viabilité cellulaire (8). Un puits de cellules à confluence ~ 70% (5 x 10 5 cellules) va créer deux boulettes, avec deux pastilles inséré par capsule du rein. </li><li> Pour préparer les culots de cellules à greffer (9), inhibiteur de ROCK incuber les cultures traitées avec de la collagénase IV pendant 5 minutes à 37 ° C CO / 5% 2. </li><li> Aspirer le IV collagénase du puits et la remplacer par une DPBS ml avec 10% de pénicilline / streptomycine (stylo / STREP). </li><li> Manuellement racler les colonies de la plaque, rincez le bien avec une 1 supplémentaires DPBS ml avec stylo / le streptocoque et le transfert de chaque aliquote de 1 ml de suspension cellulaire dans un tube de 1,5 ml de microcentrifugation. </li><li> Spin microtubes de 8000 x brièvement g, aspirer le surnageant et remettre en suspension les boulettes dans DPBS 500μl avec stylo / streptocoque. </li><li> Pour aider à lier les cellules entre elles pour une greffe, ajouter 100 ul 1 mg / ml de lectine de Phaseolus vulgaris (PHA) dans DPBS à chaque tube. </li><li> Incuber les cellules / suspension de PHA à température ambiante pendant 5 minutes, puis tourner pendant 2 minutes à 8000 x g. Tournez les tubes de 180 ° dans leur puits de rotor et de spin à nouveau pendant 2 minutes à 8000 x g. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant en laissant intacte la pastille. </li><li> Déloger les culots des tubes par un léger pipetage KSR 200 pl à côté de la bordure de la pastille jusqu&#39;à ce qu&#39;elle lève lentement. </li><li> Une fois délogés, transférer immédiatement les pellets à 0.4μm inserts Millicell placés dans les puits 3,5 cm de diamètre contenant 3 ml KSR, et incuber pendant 2 heures pour une nuit à 37 ° C / 5% de CO 2. </li></ol> III. Capsule rénale greffant <ol><li> Effectuez toutes les procédures animaux conformément aux lignes directrices institutionnelles en utilisant les règles d&#39;asepsie. </li><li> Anesthetize SCID beige (CB17.Cg-Prkdc scid Lyst bg / LCR), âgés de 8-12 semaines, en utilisant une combinaison de 3% O2 inhalé isoflurane/0.5% et tribromoéthanol intrapéritonéale (Avertin; 25 mg / kg fraîchement préparé). Deux pastilles de cellules par souris seront greffées en utilisant des techniques décrites (10). </li><li> Après avoir placé la souris sur un coussin chauffant pour prévenir l&#39;hypothermie, raser la zone d&#39;incision, puis désinfectez-les avec la chlorhexidine. Faire une incision de 2,5 cm par la peau juste à côté du centre, mais parallèle à la colonne vertébrale. </li><li> Garder la zone d&#39;incision humides avec des stériles Saline, faire une petite incision dans le muscle, juste en dessous des côtes et environ 1 cm de la colonne vertébrale. L&#39;incision doit être juste assez grand pour tirer le rein à travers, mais assez petite pour que le rein ne sera pas retomber dans la cavité abdominale sans force. </li><li> Tirez doucement le rein par l&#39;incision musculaire en utilisant une pipette Pasteur en verre qui a été tiré dans la forme d&#39;un brutal, un crochet légèrement incurvée. </li><li> Mouiller le rein avec DPBS stérile pour empêcher la capsule de se dessécher. Cela peut être nécessaire de répéter toute la procédure, comme la capsule est très fragile. </li><li> En utilisant une pince Dumont # 5, tirez doucement sur la capsule du rein et de faire une incision de 2 mm en utilisant des ciseaux à ressort Vannas. </li><li> Avec une autre pipette en verre qui a été tiré dans une très fine, une sonde émoussé, faire une petite poche entre la capsule et le rein. </li><li> Utiliser une pipette à grande orifice placé sur une pipette de transfert jetable, prenez une seule cellule de l&#39;insert à granulés Millicell. Assurez-vous de prendre aussi peu médiatique supplémentaire tout au long que possible, que les médias en excès peut interférer avec le transfert de granulés. </li><li> Tout en maintenant le bord de l&#39;incision pour créer la pochette, placez doucement le culot à côté de l&#39;ouverture et la pousser dans la poche vers un pôle du rein avec la pipette tiré. </li><li> Répétez le processus avec une seconde boulette. Placez ce sous la capsule du rein même, mais vers le pôle opposé. </li><li> Placez délicatement la capsule de retour vers le bas sur les pastilles. Les pellets doivent rester dans la poche, et pas de sutures sont nécessaires pour fermer la capsule. </li><li> Poussez doucement le rein dans la cavité abdominale et près de la paroi musculaire utilisant des sutures de soie 4-0 (ou plus petit) avec joint inverse de coupe aiguille. L&#39;incision doit être assez petit pour que seule une suture simple est nécessaire. </li><li> Fermer la peau avec une série de 4-5 points de suture interrompue, en utilisant le matériel de suture mêmes. </li><li> Avant de placer la souris de retour dans sa cage, administrer 0,05 mg / kg de buprénorphine (11,12) et 5 mg / kg de kétoprofène (12,13) ​​que les analgésiques à court terme et à long terme, respectivement. Les substances contrôlées ne doivent être utilisés conformément aux directives institutionnelles. </li><li> Transfert retour de l&#39;animal dans sa cage et lui permettre de récupérer de l&#39;anesthésie sur un coussin chauffant. Cela devrait prendre environ 20-30 minutes. </li><li> Une fois que la souris est totalement ambulatoire, il peut être retourné à l&#39;animalerie. </li></ol> IV. La récolte tératome, la fixation et de sectionnement <ol><li> À 8-12 semaines post-chirurgie, il devrait y avoir un tératome peine palpable près du rein. Large, kystes remplis de liquide se développent souvent ainsi, à partir de 6-8 semaines. Ceux-ci peuvent nécessiter une récolte plus tôt si elles causent une détresse à l&#39;animal. Depuis tératomes croître à un taux plus lent que les kystes, cependant, vous aurez envie d&#39;attendre aussi longtemps que possible pour obtenir un tératome de taille suffisante pour l&#39;analyse (c&#39;est à dire, au moins 8 semaines). </li><li> Retirez les reins, le tératome, et tout kystes entourant comme un bloc de tissu de la cavité abdominale utilisant la même approche chirurgicale par laquelle le rein a été consultée (voir Section III, les étapes 1-4 ci-dessus). </li><li> Placez le bloc entier de tissu excisé dans un tube contenant 10% de formol tamponné. </li><li> Laisser le tératome de fixer une nuit à 4 ° C. </li><li> Le lendemain, retirez le tératome du tube. Disséquer l&#39;écart des kystes rénaux et autant que possible sans endommager le tératome lui-même (figure 3). Agrandir tératomes peuvent être coupées en deux pour faciliter la dissection et l&#39;intégration. </li><li> Traiter le tératome utilisant un standard de paraffine fixation technique. Unités automatiques sont disponibles (par exemple, Hypercenter Shandon): <table border="0"><tbody><tr><td> I. </td><td> 80% d&#39;alcool Flex </td><td> 2 heures </td></tr><tr><td> II. </td><td> 80% d&#39;alcool Flex </td><td> 1 heure </td></tr><tr><td> III. </td><td> 85% d&#39;alcool Flex </td><td> 1,5 heures </td></tr><tr><td> IV. </td><td> 95% d&#39;alcool Flex </td><td> 1 heure </td></tr><tr><td> V. </td><td> 100% d&#39;alcool Flex </td><td> 1 heure </td></tr><tr><td> VI. </td><td> 100% d&#39;alcool Flex </td><td> 1 heure </td></tr><tr><td> VII. </td><td> 100% d&#39;alcool Flex </td><td> 1 heure </td></tr><tr><td> VIII. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> 1 heure </td></tr><tr><td> IX. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> 1 heure </td></tr><tr><td> X. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> 1 heure </td&gt; </tr><tr><td> XI. </td><td> Paraffine (TissuePrep) </td><td> 2 heures </td></tr><tr><td> XII. </td><td> Paraffine (TissuePrep) </td><td> 2 heures </td></tr></tbody></table></li></ol> V. L&#39;immunohistochimie et d&#39;analyse <ol><li> Une fois incorporé dans de la paraffine, la section de 5 um tératome tranches série à l&#39;aide d&#39;un microtome rotatif, et les sections flottent sur des lames. </li><li> Avant coloration, cuire les diapositives pour au moins une heure. </li><li> Colorer les diapositives à l&#39;hématoxyline et l&#39;éosine en utilisant des méthodes standard pour identifier les structures des tissus représentant de chacun des trois feuillets embryonnaires (figure 4): <table border="0"><tbody><tr><td> I. </td><td> Lavez Xylène </td><td> 3-5 minutes </td></tr><tr><td> II. </td><td> Xylène </td><td> 3-5 minutes </td></tr><tr><td> III. </td><td> D&#39;alcool à 100% </td><td> 3-5 minutes </td></tr><tr><td> IV. </td><td> D&#39;alcool à 100% </td><td> 3-5 minutes </td></tr><tr><td> V. </td><td> 95% d&#39;alcool </td><td> 3-5 minutes </td></tr><tr><td> VI. </td><td> 80% d&#39;alcool </td><td> 3-5 minutes </td></tr><tr><td> VII. </td><td> L&#39;eau de lavage (plusieurs changements) </td><td> 2 minutes </td></tr><tr><td> VIII. </td><td> Gill hématoxyline # 3 </td><td> 2-5 minutes </td></tr><tr><td> IX. </td><td> L&#39;eau de lavage (plusieurs changements) </td><td> jusqu&#39;à ce l&#39;eau soit claire </td></tr><tr><td> X. </td><td> Scott eau (pour les noyaux en bleu) </td><td> 3 minutes ou plus </td></tr><tr><td> XI. </td><td> L&#39;eau de lavage (plusieurs changements) </td><td> 1-2 minutes </td></tr><tr><td> XII. </td><td> Éosine Y </td><td> 1 minute </td></tr><tr><td> XIII. </td><td> L&#39;eau de lavage (plusieurs changements) </td><td> 30 secondes </td></tr><tr><td> XIV. </td><td> 80% d&#39;alcool </td><td> 1 minute </td></tr><tr><td> XV. </td><td> 95% d&#39;alcool </td><td> 2 minutes </td></tr><tr><td> XVI. </td><td> 95% d&#39;alcool </td><td> 2 minutes </td></tr><tr><td> XVII. </td><td> D&#39;alcool à 100% </td><td> 3 minutes </td></tr><tr><td> XVIII. </td><td> 100% d&#39;alcool (propre) </td><td> 3 minutes </td></tr><tr><td> XIX. </td><td> Xylène </td><td> 2 minutes ou plus </td></tr><tr><td> XX. </td><td> Xylène </td><td> 2 minutes ou plus </td></tr></tbody></table></li><li> Monter une lamelle sur chaque diapositive avec Permount. </li></ol> VI. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Placage des fibroblastes de souris irradiées CF1 embryonnaires comme une couche nourricière pour les CSEh culture indifférencié. FAE sont plaqués au confluent ~ 50%, comme indiqué ici, ou 4 x 10 5 cellules par 3,5 cm de diamètre bien dans une boîte de culture de 6 puits. Bar, 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. CSEh exemple de la culture des CSEh indifférenciées subconfluentes sur une couche nourricière MEF. Sont cultivés sur des couches nourricières MEF jusqu&#39;au confluent ~ 70%, comme indiqué ici, puis repiquées comme décrit. Bar, 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Exemple de tératomes explantés. Après explantation, le tératome, le rein, et tout tissu accessoires sont fixés comme un bloc dans le formol, puis les reins et les tissus accessoires sont soigneusement taillées loin avant enrobage dans la paraffine. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Tératomes dérivées de CSEh indifférenciées contiennent représentatifs des tissus de toutes les couches de germe de trois en vivo. Un tératome, comme celui représenté dans la figure 3, a été sectionné et colorées à l&#39;hématoxyline et l&#39;éosine pour identifier les tissus embryonnaires. CSEh donner lieu à des tissus provenant des trois feuillets embryonnaires (ectoderme (A, B), mésoderme (C), l&#39;endoderme (D). (A) la structure naissante du tube neural. (B) épithélium primitif. (C) entouré par une capsule de cartilage du mésenchyme condensé. (D) la structure glandulaire intestinale. Bar, 100 um. Images reproduites avec l&#39;autorisation de l&#39;auteur. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Analyse tératome peut être utilisé pour cartographier le sort de étiquetés, CSEh indifférenciées. Comme précédemment publié (9), un mélange de CSEh spécifiquement marqués avec CSEh non marquées peuvent être utilisées pour cartographier le sort des cellules marquées dans un dosage de la formation de tératome. Comme le montre ici, CSEh indifférenciées exprimant le marqueur de surface, CD133, et étiqueté avec la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP), ont été mélangés avec non balisés, CSEh indifférenciées. Ils ont été utilisés pour former des tératomes par capsule rénale greffe. L&#39;analyse immunohistochimique de l&#39;hématoxyline et l&#39;éosine tératome sections colorées avec des anticorps anti-eGFP démontre le sort de l&#39;neuroectodermique CD133 + CSEh. Tératomes ont été traitées comme dans la figure 4 et de contraste avec des anticorps anti-eGFP (marron) pour localiser des dérivés de cellules CD133 + cellules GFP + dans les tissus. CD133 + cellules dérivées (flèches) ont été observées dans les tissus provenant de l&#39;ectoderme embryonnaire, l&#39;épithélium spécifiquement neural (à gauche) et du tube neural naissante structures similaires (à droite). Bar, 100 um. Images reproduites avec l&#39;autorisation de l&#39;auteur. Gélatine <ul><li> 0,1% gélatine porcine </li><li> DPBS 99,9% <ul><li> Ajouter la gélatine au DPBS, incuber à 37 ° C pendant une heure ou jusqu&#39;à ce que la gélatine tous les passe en solution, et stériliser par filtration (0.22μm) avant utilisation. </li></ul></li></ul> MEF moyennes <ul><li> 10% de sérum fœtal bovin (qualifié) </li><li> Dulbecco 90% de modification Essential Medium (D-MEM) </li><li> 1x L-Glutamine </li><li> 1x Pen / Strep <ul><li> Stériliser par filtration avant l&#39;utilisation. </li></ul></li></ul> KSR (Remplacement Knockout sérum) moyenne <ul><li> 20% de remplacement du sérum KnockOut </li><li> 80% KnockOut D-MEM </li><li> 1x L-Glutamine </li><li> 1x acides aminés non essentiels </li><li> 0,1 mM β-mercaptoéthanol / </li><li> 12,5 ng / ml de bFGF <ul><li> Stériliser par filtration. </li><li> Conserver à 4 ° C, mais au chaud à 37 ° C avant d&#39;ajouter aux cellules. </li><li> Ajouter bFGF immédiatement avant utilisation. </li></ul></li></ul> Collagénase IV <ul><li> Dissoudre 1 mg / ml dans le milieu KSR en plaçant à 37 ° C pendant 1-2 heures ou jusqu&#39;à ce que toute la poudre passe en solution. </li><li> Stériliser par filtration. </li></ul> Avertin <ul><li> 0,25 g de 2,2,2-tribromoéthanol </li><li> 0,25 ml de 2-méthyl-2-butanol <ul><li> Incuber à 37 ° C pendant la nuit pour former une solution 100%. </li><li> Plusieurs heures avant la chirurgie, une solution diluée à 2,5% de travail en utilisant DPBS et incuber à 37 ° C pendant au moins 1 heure. </li><li> Filtre stériliser et aliquote. </li><li> Tribromoéthanol est très sensible à la lumière, afin de protéger de la lumière à toutes les étapes de préparation et d&#39;utilisation. </li><li> Préparer pas plus de 12-24 heures avant utilisation. </li></ul></li></ul> La buprénorphine <ul><li> 1 mg / ml de solution concentrée dans le méthanol <ul><li> Diluer à 0,015 mg / ml, solution de travail en utilisant stériles H 2 O. </li><li> Conserver à -20 ° C jusqu&#39;à un mois. </li></ul></li></ul> Le kétoprofène <ul><li> 0,5 mg / ml, solution de travail dans DPBS <ul><li> Ajouter DPBS, incuber une nuit à 37 ° C pendant 1-2 heures ou jusqu&#39;à ce que toute la poudre passe en solution. </li><li> Filtre stériliser et conserver à 4 ° C. </li></ul></li></ul>

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Nous avons adapté un test de tératome très efficace de formation dans le but de cartographier le sort de différencier les CSEh dans un environnement in vivo. Un petit nombre de CSEh spécialement sélectionnés est mélangé avec indifférencié CSEh lectine de type sauvage et Phaseolus vulgaris pour former un culot cellulaire. Ceci est greffée sous la capsule rénale de souris immunodéficientes une. Le sort des CSEh initialement sélectionné peut alors être déterminé par immunohistochimie (figure 5), comme indiqué précédemment (9). Cette méthode fournit un outil précieux pour identifier et générer tissu-spécifique des réactifs pour thérapie cellulaire.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2-Methyl-2-butanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>240486</td>
<td>Avertin</td>
</tr>
<tr>
<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T48402</td>
<td>Avertin</td>
</tr>
<tr>
<td>4-0 silk sutures</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>641G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>bFGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D Systems</td>
<td>233FB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buprenorphine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>B7536</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clear-Rite 3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-046-341</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase IV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C5138</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11965</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dupont #5 forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>500233</td>
<td>Kidney capsule</td>
</tr>
<tr>
<td>Eosin Y</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>23-245-658</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (Qualified)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>26140-079</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flex alcohol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-046344</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gill&#x2019;s Hematoxylin #3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-050-204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hemostat, straight</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>501241</td>
<td>General surgery</td>
</tr>
<tr>
<td>Iris forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>15914</td>
<td>General surgery</td>
</tr>
<tr>
<td>Ketoprofen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>K2012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KnockOut D-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10829</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KnockOut Serum Replacement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10828-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25020-081</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MILLICELL inserts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>PICM01250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nonessential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11140-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Operating scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>501754</td>
<td>General surgery</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraffin (TissuePrep)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>8002-74-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Permount</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SP15-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PHA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>L1668</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Porcine gelatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G6144</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ROCK inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>Y-27632</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SCID beige mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Charles River </td>
<td>250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scott&#x2019;s Wash</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>6697-32</td>
<td>Ricca Chemicals</td>
</tr>
<tr>
<td>Vannas spring scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>14003</td>
<td>Kidney capsule</td>
</tr>
<tr>
<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M7522</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fate mapping of human embryonic stem cells by teratoma formation

Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ont une capacité illimitée de l&#39;auto-renouvellement, et la capacité de se différencier en cellules provenant de chacun des trois feuillets embryonnaires (1). Différenciation dirigée des CSEh dans les types cellulaires spécifiques a suscité beaucoup d&#39;intérêt dans le domaine de la médecine régénérative (par exemple, (2-5)), et des méthodes pour la détermination de la<em&gt; In vivo</emLe destin&gt; des CSEh sélectionnés ou manipulés sont essentiels à cet effort. Nous avons adapté un test très efficace la formation de tératome à cet effet. Un petit nombre de CSEh spécialement sélectionnés est mélangé avec indifférencié CSEh lectine de type sauvage et Phaseolus vulgaris pour former un culot cellulaire. Ceci est greffée sous la capsule rénale de souris immunodéficientes une. Aussi peu que 2,5 x 10<sup&gt; 5</supCSEh&gt; sont nécessaires pour former un 16 cm<sup&gt; 3</supTératome&gt; dans les 8-12 semaines. Le sort des CSEh initialement sélectionné peut alors être déterminée par immunohistochimie. Cette méthode fournit un outil précieux pour caractériser tissu-spécifique des réactifs pour thérapie cellulaire.

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Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Différenciation dirigée des CSEh dans des cellules spécifiques a suscité beaucoup d&#39;intérêt en médecine régénérative. Nous fournissons un résumé concis, étape par étape pour déterminer le protocole de<em&gt; In vivo</emLe destin&gt; des CSEh sélectionnés qui offre un outil précieux pour caractériser tissu-spécifique des réactifs pour thérapie cellulaire.

Cartographie sort des cellules souches embryonnaires humaines par la formation de tératome

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

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Research

JoVE Journal

Biology

17.1K vues.  University of California San Francisco. Différenciation dirigée des CSEh dans des cellules spécifiques a suscité beaucoup d'intérêt en médecine régénérative. Nous fournissons un résumé concis, étape par étape pour déterminer le protocole de In vivo des CSEh sélectionnés qui offre un outil précieux pour caractériser tissu-spécifique des réactifs pour thérapie cellulaire.

Vidéo: Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Yeah, so I'm Lauren Deon. I'm in charge of the Human Amgen stem cell co facility at MGH. Yeah, so I'm Lauren, I'm in charge of the Human AM stem cell co facility at MGH.So I've been working with human Amgen stem cells for years now since I was a postdoc in George De Lab before, from four, four years. And so right now we have two cell lines, H one and H nine, which are both from Y cell. And so the way we are expanding or maintaining these cells in culture is by, at least the way we are splitting these cells is by using collagenous.So what I usually do is for the first few passage after throwing the cells, I use a technical, the picking colonies. So in this case, I can check under the microscope which colonies are good and differentiate and nice shape, and I will collect only these colonies and I will cut them in few pieces and put them back in, in a fresh flat. And the, the colonies that look kind of differentiate it are just left them alone.The other way to pass the cells is by using trypsin. So I don't use this technique here. I think collagenase is a little bit safer because human being stem cells don't like to be individualized or they don't like to be alone.So if you do trypsin, if you use trypsin for a little bit too long, if you use it for like three to four minutes, which is the way we use strips in for other type of cells, human stem cells will be individualized and most of them will die or just differentiate or will not attach to the myth. So the idea is you have to keep the cells as clumps. You don't want them to be alone in the in, in the flask.So using collagenase, the advantage is to keep cells as plants. Using chipsy, you just select for cells that will survive this very, very harsh process of g opsonization. So these cells are usually very highly proliferative.So you get, you can adapt your cells to this tripsin process. The problem is that you have cells that they behave differently, they go much faster. And one risk is that you can get some commercial abnormality to, to this, to this very high division process.So you say that ization can cause selection of cells in culture for most proliferative cells.Right. More ative and probably also higher survival rates than other cells. So after proliferation, basically culture after proliferation in tripsin, after several passages become a different culture, these different properties.So it's, it's hard to figure out if they are exactly identical. If you do the test, the usual test, let's say you check markers, regular markers of end differentiated cells like OC four, nano one 60 SC four C, C3, all this molecule might still be expressed. If you do TER formation, this cells might still differentiate and be formed like al like normal cells.If you look at the karyotype, you might have some abnormality, but you might still have a normal karyotype. The, the, the selective advantage might be due to just a mutation that you cannot see by doing a karyotype. So the fact that they grow much faster is by itself I think a little bit worser.And if we want to use these cells for transplantation at some point, I would definitely not use this type of cells.Okay. So would you like to tell me what are the main technical problems with using this technique for, for passages of cells? So using S, yes.It's just a little bit longer and also it's, since the cells are not going as fast, it's just much longer to get a high number of cells to do some experiment. So it's just less convenient I would say. Would you like to tell me about few words about the goals of your experiment?How do you use CS cells? Okay, so my main project here is to get endothelial cells from human AB stem cells. And the idea is to be able to make blood.And we are working a lot with tissue bioengineering labs and one of their goal is to make tissue in vitro. But one of the limitation to this is the lack of blood vessels going through this tissues. So if we can bring endothelial cells or put endothelial cells in this tissue, we would have better growth of this tissue.So the idea few sources of cells are known for endothelial cells like cold blood or pressure blood, but it would be interesting to have another source of cells like human years. And the advantage is since human years can be expanded and most infinitely, you could modify these cells, make some inducible system and be able to use it. Then in your final product, your material cells, in this case.

Propagation des souches embryonnaires humaines (ES) Cellules

Recherche

Biologie

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Dérivation de cellules souches hématopoïétiques de cellules souches embryonnaires murines

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Dérivation des cellules souches embryonnaires humaines par Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

Palpage pour activité complexe mitochondrial dans les cellules souches embryonnaires humaines

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Immunoprécipitation de la chromatine des cellules souches embryonnaires humaines

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

Marquage in vitro des cellules souches embryonnaires humaines pour l&#39;imagerie par résonance magnétique

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

Culture et entretien des cellules souches embryonnaires humaines

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

Préparation Étaler chromosomique des cellules souches embryonnaires humaines pour le caryotype

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congélation et de décongélation cellules souches embryonnaires humaines

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

La différenciation des cellules souches embryonnaires en précurseurs d&#39;oligodendrocytes

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...