Este trabalho foi financiado por uma bolsa de pesquisa abrangente do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (RC1-00104), um Serviço de Saúde Pública Grant (HL085377) de NHLBI, e um presente da Fundação Pollin para HSB

O protocolo escrito abaixo é baseada em parâmetros publicados relatado pelos autores, com algumas modificações. O protocolo é realizada com a aprovação do Animal Care UCSF Institucional e Use (IACUC) e Supervisão Stem Cell Research (SCRO) Comités. I. Cultura de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) <ol><li> HESCs crescer no padrão 6-bem (3,5 cm de diâmetro poços) placas. </li><li> Pelo menos 12 horas antes da passaging células, fibroblastos de sementes embrionárias de rato (MEF; obtido a partir de camundongos CF1 dia e12.5 timed-acoplado, irradiados em 1000 Ci) alimentador de células em placas revestidas com gelatina 1% (6,7). MEFs deve ser banhado em 50-60 confluência%, ou 4 x 10 5 células por 3,5 cm de diâmetro bem (Figura 1). </li><li> Células passagem quando colônias atingiram confluência ~ 70% (Figura 2). </li><li> A passagem das células, o crescimento médio aspirar KSR (6) dos poços e substituir com 0,5 ml de meio contendo colagenase IV em KSR em uma concentração de 1 mg / ml. </li><li> Incubar as placas com colagenase IV a 37 ° C / 5% CO 2 por 5 minutos ou até que as bordas de colônias começam a levantar a partir da placa. </li><li> Remover colagenase IV da placa, adicionar 0,5 ml de KSR a cada poço, e manualmente raspar células para remover completamente a partir da placa. </li><li> Recolher a suspensão de células de cada lugar, bem em um tubo de 15 ml cônico, e permitem que as células de resolver pela força da gravidade por 5 minutos. </li><li> Remover o sobrenadante do tubo, deixando as células e médias empresas em um volume total de ~ 300 ul. </li><li> Usando um conjunto de 200 micro-pipetador mL no volume máximo, gentilmente pipeta suspensão de células 5-6 vezes para acabar com as colônias. </li><li> Traga a suspensão de célula para um volume total de 9 ml por poço original de células usando KSR médio (ou seja, se um bem é colhida, o tubo deve conter 9 ml). Suplementar o meio com recombinante fator de crescimento básico de fibroblastos humanos (bFGF) a uma concentração de 12,5 ng / ml. </li><li> Depois de lavar a novos poços contendo células MEF (consulte a etapa 2) com fosfato de Dulbecco solução salina tamponada (DPBS) para remover todos os soro, adicionar 3 ml de suspensão de células para cada poço e incubar as placas a 37 ° CO C / 5% 2. </li><li> Alterar médio KSR com bFGF 24 horas após a passagem, e cada 24-48 horas até que as células estão prontas para serem várias passagens novamente. </li></ol> II. Preparação de CTEh pellet para enxertia <ol><li> Menos 24 horas antes de enxertia, adicione inibidor ROCHA ao meio KSR para uma concentração final de 10μM de aumentar a viabilidade celular (8). Um poço de células em confluência ~ 70% (5 x 10 5 células) vai criar dois pellets, com dois pellets inserido por cápsula renal. </li><li> Para preparar pellets de células para enxertia (9), incubar a ROCHA inibidor tratados com culturas com colagenase IV por 5 minutos a 37 ° CO C / 5% 2. </li><li> Aspirar o IV colagenase do poço e substituir por um DPBS ml com 10% de penicilina / estreptomicina (pen / strep). </li><li> Manualmente raspar as colônias da placa, lavar bem com um adicional de 1 ml DPBS com caneta / strep, e transferência de cada alíquota de 1ml de suspensão celular para um microtubo de 1,5 ml. </li><li> Girar tubos de microcentrífuga brevemente a 8.000 x g, aspirar o sobrenadante e ressuspender as pelotas em DPBS 500μl com caneta / strep. </li><li> Para ajudar a vincular a células juntas para transplante, adicionar 100μl 1 mg / ml de lectina de Phaseolus vulgaris (PHA) em DPBS a cada tubo. </li><li> Incubar a célula / suspensão PHA em temperatura ambiente por 5 minutos, em seguida, girar durante 2 minutos a 8.000 x g. Girar os tubos de 180 ° dentro de seus poços de rotor e girar novamente por 2 minutos a 8.000 x g. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante deixando o pellet intacta. </li><li> Desalojar os pellets de células dos tubos com cuidado pipetando KSR 200μl junto à borda da pelota até que lentamente se levanta. </li><li> Uma vez deslocada, transferir imediatamente as pelotas de 0.4μm insere MILLICELL colocados em poços 3,5 cm de diâmetro contendo 3 ml KSR, e incubar por 2 horas durante a noite a 37 ° C / 5% CO 2. </li></ol> III. Cápsula renal enxertia <ol><li> Executar todos os procedimentos animal, em conformidade com as diretrizes institucionais, utilizando técnica asséptica apropriada. </li><li> Anestesiar ratos SCID bege (CB17.Cg-Prkdc scid Lyst bg / Crl), com idades entre 8-12 semanas, usando uma combinação de O2 inalado 3% isoflurane/0.5% e tribromoetanol intraperitoneal (Avertin; 25 mg / kg preparada na hora). Dois pellets por célula do rato será enxertada usando técnicas descritas (10). </li><li> Depois de colocar o mouse sobre uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia, raspar a área da incisão, em seguida, desinfectá-la com clorexidina. Faça uma incisão de 2,5 cm através da pele apenas fora do centro, mas paralelo à coluna vertebral. </li><li> Mantendo a área úmida incisão com salin estérile, fazer uma pequena incisão através do músculo, logo abaixo das costelas e ~ 1 cm da coluna vertebral. A incisão deve ser grande o suficiente para puxar o rim através, mas pequeno o suficiente para que o rim não vai escorregar de volta para dentro da cavidade abdominal sem força. </li><li> Puxe delicadamente o rim através da incisão do músculo através de um vidro Pasteur pipeta que tem sido puxado para dentro da forma de um gancho, sem corte ligeiramente curvada. </li><li> Molhar o rim com DPBS estéril para evitar a cápsula de secar. Isto pode ser necessário repetir todo o procedimento, como a cápsula é muito frágil. </li><li> Utilizando uma pinça Dumont # 5, puxe a cápsula a partir do rim e fazer uma incisão 2 milímetros usando uma tesoura primavera Vannas. </li><li> Com outra pipeta de vidro que foi colocado em uma sonda muito fina, embotado, faça uma pequena bolsa entre a cápsula eo rim. </li><li> Usando uma ponteira de grande orifício colocado em uma pipeta de transferência descartável, tomar uma única célula pellet a partir da inserção MILLICELL. Certifique-se de ter tão pouco de mídia extra junto possível, como a mídia em excesso pode interferir com a transferência da pelota. </li><li> Segurando na borda da incisão para criar o bolso, coloque delicadamente o sedimento ao lado da abertura e empurre-o no bolso em direção a um pólo do rim com a pipeta puxado. </li><li> Repita o processo com uma pelota segundo. Coloque este sob a cápsula do rim mesmo, mas em direção ao pólo oposto. </li><li> Cuidadosamente coloque a cápsula de volta para a pellets. As pelotas deve ficar dentro do bolso, e sem suturas são necessárias para fechar a cápsula. </li><li> Com cuidado, empurre o rim de volta para a cavidade abdominal e fechar a parede muscular utilizando fio de seda 4-0 (ou menor) com agulha de corte reverso ligado. A incisão deve ser pequeno o suficiente para que apenas uma única sutura é necessário. </li><li> Feche a pele com uma série de 4-5 pontos interrompidos, utilizando o mesmo material de sutura. </li><li> Antes de colocar o mouse de volta em sua gaiola, administrar 0,05 mg / kg de buprenorfina (11,12) e 5 mg / kg de cetoprofeno (12,13) ​​como analgésicos de curto prazo e longo prazo, respectivamente. Substâncias controladas só deve ser utilizado de acordo com as diretrizes institucionais. </li><li> Transferir os animais de volta para sua gaiola e permitir que ele se recupera da anestesia em uma almofada de aquecimento. Isso deve levar cerca de 20-30 minutos. </li><li> Uma vez que o mouse é totalmente ambulatorial, ele pode ser devolvido para a instalação de habitação animal. </li></ol> IV. Colheita teratoma fixação, e secção <ol><li> Em 8-12 semanas após a cirurgia, deve haver um teratoma quase palpável perto do rim. Grande, cheio de líquido cistos, muitas vezes, desenvolver, bem como, a partir de 6-8 semanas. Estes podem necessitar de uma colheita mais cedo, se eles causam sofrimento ao animal. Desde teratomas crescer a taxas mais lentas do que cistos, no entanto, você vai querer esperar tanto tempo quanto possível para obter um teratoma de tamanho suficiente para a análise (ou seja, pelo menos 8 semanas). </li><li> Remover o rim, teratoma, e qualquer cistos em torno de um bloco de tecido da cavidade abdominal utilizando a mesma abordagem cirúrgica pela qual o rim foi originalmente acessado (consulte a Seção III, os passos 1-4 acima). </li><li> Coloque todo o bloco de tecido excisado em um tubo contendo formol tamponado 10%. </li><li> Permitir que o teratoma para corrigir durante a noite a 4 ° C. </li><li> No dia seguinte, retire o teratoma do tubo. Dissecar fora qualquer cistos nos rins e, tanto quanto possível sem danificar o teratoma si (Figura 3). Teratomas maiores podem ser cortados ao meio para facilitar a dissecção e incorporação. </li><li> O processo de teratoma usando uma técnica de fixação de parafina padrão. Unidades automáticos estão disponíveis (por exemplo, hipercentro Shandon): <table border="0"><tbody><tr><td> I. </td><td> 80% de álcool Flex </td><td> 2 horas </td></tr><tr><td> II. </td><td> 80% de álcool Flex </td><td> Uma hora </td></tr><tr><td> III. </td><td> 85% de álcool Flex </td><td> 1,5 horas </td></tr><tr><td> IV. </td><td> 95% de álcool Flex </td><td> Uma hora </td></tr><tr><td> V. </td><td> 100% de álcool Flex </td><td> Uma hora </td></tr><tr><td> VI. </td><td> 100% de álcool Flex </td><td> Uma hora </td></tr><tr><td> VII. </td><td> 100% de álcool Flex </td><td> Uma hora </td></tr><tr><td> VIII. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> Uma hora </td></tr><tr><td> IX. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> Uma hora </td></tr><tr><td> X. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> Uma hora </td&gt; </tr><tr><td> XI. </td><td> Parafina (TissuePrep) </td><td> 2 horas </td></tr><tr><td> XII. </td><td> Parafina (TissuePrep) </td><td> 2 horas </td></tr></tbody></table></li></ol> V. Imunohistoquímica e análise <ol><li> Uma vez incorporado na seção de parafina, o teratoma em 5m cortes seriados usando um micrótomo rotativo, e as seções flutuam em slides. </li><li> Antes de coloração, cozer os slides por pelo menos uma hora. </li><li> Mancha as lâminas com hematoxilina e eosina usando métodos padrão para identificar estruturas de tecidos representante de cada um dos três folhetos embrionários (Figura 4): <table border="0"><tbody><tr><td> I. </td><td> Lavagem de xileno </td><td> 3-5 minutos </td></tr><tr><td> II. </td><td> Xileno </td><td> 3-5 minutos </td></tr><tr><td> III. </td><td> Álcool 100% </td><td> 3-5 minutos </td></tr><tr><td> IV. </td><td> Álcool 100% </td><td> 3-5 minutos </td></tr><tr><td> V. </td><td> Álcool a 95% </td><td> 3-5 minutos </td></tr><tr><td> VI. </td><td> 80% de álcool </td><td> 3-5 minutos </td></tr><tr><td> VII. </td><td> Lavagem com água (diversas alterações) </td><td> 2 minutos </td></tr><tr><td> VIII. </td><td> Hematoxilina de Gill # 3 </td><td> 2-5 minutos </td></tr><tr><td> IX. </td><td> Lavagem com água (diversas alterações) </td><td> até que a água corre claro </td></tr><tr><td> X. </td><td> Água Scott (para núcleos azul) </td><td> 3 minutos ou mais </td></tr><tr><td> XI. </td><td> Lavagem com água (diversas alterações) </td><td> 1-2 minutos </td></tr><tr><td> XII. </td><td> Eosina Y </td><td> Um minuto </td></tr><tr><td> XIII. </td><td> Lavagem com água (diversas alterações) </td><td> 30 segundo </td></tr><tr><td> XIV. </td><td> 80% de álcool </td><td> Um minuto </td></tr><tr><td> XV. </td><td> Álcool a 95% </td><td> 2 minutos </td></tr><tr><td> XVI. </td><td> Álcool a 95% </td><td> 2 minutos </td></tr><tr><td> XVII. </td><td> Álcool 100% </td><td> 3 minutos </td></tr><tr><td> XVIII. </td><td> 100% de álcool (limpo) </td><td> 3 minutos </td></tr><tr><td> XIX. </td><td> Xileno </td><td> 2 minutos ou mais </td></tr><tr><td> XX. </td><td> Xileno </td><td> 2 minutos ou mais </td></tr></tbody></table></li><li> Montar uma lamela em cada slide com Permount. </li></ol> VI. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Chapeamento de fibroblastos irradiados CF1 embrionárias de rato como uma camada de alimentação para hESCs cultura indiferenciada. MEFs são banhados em ~ confluência de 50%, como mostrado aqui, ou 4 x 10 5 células por 3,5 cm de diâmetro bem em uma placa de cultura de 6 bem. Bar, 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. HESCs exemplo da cultura confluentes de hESCs indiferenciados em uma camada de alimentação MEF. São cultivadas em camadas alimentador MEF até confluentes ~ 70%, como mostrado aqui, então várias passagens como descrito. Bar, 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Exemplo de teratomas explantado. Seguindo explante, o teratoma, rim e qualquer tecido acessório são fixos como um bloco em formalina, em seguida, o rim e tecido acessório são cuidadosamente aparado antes de inclusão em parafina. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Teratomas derivado hESCs indiferenciada conter tecidos representativos de todos os três camadas germinativas in vivo. Um teratoma, como um representado na Figura 3, foi seccionado e corado com hematoxilina e eosina para identificar tecidos embrionários. hESCs dar origem a tecidos derivados dos três folhetos embrionários (ectoderma (A, B), mesoderma (C), endoderme (D). (A) estrutura do tubo neural Nascente. (B) epitélio escamoso primitivo. (C) Cartilagem rodeado por cápsula de mesênquima condensado. (D) estrutura glandular intestinal. Bar, 100 mm. Imagens reproduzidas com permissão do autor. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Análise teratoma pode ser usado para mapear o destino do tag, hESCs indiferenciada. Como já publicados (9), uma mistura de hESCs especificamente marcados com hESCs untagged pode ser usado para mapear o destino das células marcado em um ensaio de formação de teratomas. Como mostrado aqui, hESCs indiferenciada expressando o marcador de superfície, CD133, e marcou com a proteína verde fluorescente melhorada (eGFP), foram misturados com untagged, hESCs indiferenciada. Estes foram usados ​​para formar teratomas pela cápsula renal enxertia. Análise imunohistoquímica de hematoxilina e eosina seções manchadas de teratoma com anticorpo anti-eGFP demonstra o destino neuroectodérmico da CD133 hESCs +. Teratomas foram processados ​​como na Figura 4 e contrastado com anticorpo anti-eGFP (marrom) para localizar os derivados de células CD133 + + GFP dentro dos tecidos. CD133 + células derivadas (setas) foram observadas nos tecidos decorrentes da ectoderma embrionário, especificamente epitélio neural (esquerda) e nascente do tubo neural estruturas semelhantes (à direita). Bar, 100 mm. Imagens reproduzidas com permissão do autor. Gelatina <ul><li> 0,1% de gelatina Porcina </li><li> DPBS 99,9% <ul><li> Adicione a gelatina para DPBS, incubar a 37 ° C por uma hora ou até que todos gelatina entra em solução, e filtro de esterilizar (0.22μm) antes do uso. </li></ul></li></ul> MEF médio <ul><li> 10% de soro fetal bovino (Qualificado) </li><li> Dulbecco 90% do Modified Meio Essencial (D-MEM) </li><li> 1x L-Glutamina </li><li> 1x Pen / Strep <ul><li> Filtro de esterilizar antes do uso. </li></ul></li></ul> KSR médio (substituição Knockout Serum) <ul><li> Substituição de soro de 20% KnockOut </li><li> 80% KnockOut D-MEM </li><li> 1x L-Glutamina </li><li> 1x aminoácidos não essenciais </li><li> 0,1 mM β-mercaptoetanol / </li><li> 12,5 ng / ml bFGF <ul><li> Filtro de esterilizar. </li><li> Armazenar a 4 ° C, mas quente a 37 ° C antes de adicionar às células. </li><li> Adicionar bFGF imediatamente antes da utilização. </li></ul></li></ul> Colagenase IV <ul><li> Dissolver 1 mg / ml em meio KSR, colocando a 37 ° C por 1-2 horas ou até todo o pó entra em solução. </li><li> Filtro de esterilizar. </li></ul> Avertin <ul><li> 0,25 g 2,2,2-tribromoetanol </li><li> 0,25 ml 2-metil-2-butanol <ul><li> Incubar a 37 ° C durante a noite para formar uma solução 100%. </li><li> Várias horas antes da cirurgia, diluir a 2,5% solução de trabalho usando DPBS e incubar a 37 ° C durante pelo menos 1 hora. </li><li> Filtro de esterilizar e alíquota. </li><li> Tribromoetanol é altamente sensível à luz, de modo a proteger da luz em todas as fases de preparação e uso. </li><li> Prepare não mais de 12-24 horas antes de usar. </li></ul></li></ul> Buprenorfina <ul><li> 1 mg / ml solução estoque em metanol <ul><li> Diluir a 0,015 mg / ml solução estéril de trabalho usando H 2 O. </li><li> Armazenar a -20 ° C por até 1 mês. </li></ul></li></ul> Cetoprofeno <ul><li> 0,5 mg / ml solução de trabalho na DPBS <ul><li> Adicionar DPBS, incubar overnight a 37 ° C por 1-2 horas ou até todo o pó entra em solução. </li><li> Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C. </li></ul></li></ul>

<ol>
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Não há conflitos de interesse declarados.

Nós adaptamos um ensaio de formação altamente eficiente teratoma com a finalidade de mapear o destino de diferenciar hESCs em um ambiente em vivo. Um pequeno número de hESCs especificamente selecionados é misturado com indiferenciada hESCs tipo selvagem e lectina Phaseolus vulgaris para formar um pellet de células. Este é enxertada embaixo da cápsula renal em um mouse imunodeficientes. O destino do hESCs originalmente selecionado pode então ser determinada por imuno-histoquímica (Figura 5), conforme relatado anteriormente (9). Este método fornece uma valiosa ferramenta para identificar e gerar tecidos específicos reagentes para celular baseado em terapia.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2-Methyl-2-butanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>240486</td>
<td>Avertin</td>
</tr>
<tr>
<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T48402</td>
<td>Avertin</td>
</tr>
<tr>
<td>4-0 silk sutures</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>641G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>bFGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D Systems</td>
<td>233FB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buprenorphine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>B7536</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clear-Rite 3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-046-341</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase IV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C5138</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11965</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dupont #5 forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>500233</td>
<td>Kidney capsule</td>
</tr>
<tr>
<td>Eosin Y</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>23-245-658</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (Qualified)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>26140-079</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flex alcohol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-046344</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gill&#x2019;s Hematoxylin #3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-050-204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hemostat, straight</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>501241</td>
<td>General surgery</td>
</tr>
<tr>
<td>Iris forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>15914</td>
<td>General surgery</td>
</tr>
<tr>
<td>Ketoprofen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>K2012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KnockOut D-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10829</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KnockOut Serum Replacement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10828-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25020-081</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MILLICELL inserts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>PICM01250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nonessential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11140-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Operating scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>501754</td>
<td>General surgery</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraffin (TissuePrep)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>8002-74-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Permount</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SP15-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PHA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>L1668</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Porcine gelatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G6144</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ROCK inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>Y-27632</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SCID beige mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Charles River </td>
<td>250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scott&#x2019;s Wash</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>6697-32</td>
<td>Ricca Chemicals</td>
</tr>
<tr>
<td>Vannas spring scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>14003</td>
<td>Kidney capsule</td>
</tr>
<tr>
<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M7522</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fate mapping of human embryonic stem cells by teratoma formation

Células estaminais embrionárias humanas (hESCs) têm uma capacidade ilimitada de auto-renovação ea capacidade de se diferenciar em células derivadas de todos os três folhetos embrionários (1). Diferenciação dirigida de hESCs em tipos específicos de células tem gerado muito interesse no campo da medicina regenerativa (por exemplo, (2-5)), e métodos para determinar o<em&gt; In vivo</em&gt; Destino de hESCs selecionados ou manipulados são essenciais para este esforço. Nós adaptamos um ensaio de formação altamente eficiente teratoma para esta finalidade. Um pequeno número de hESCs especificamente selecionados é misturado com indiferenciada hESCs tipo selvagem e lectina Phaseolus vulgaris para formar um pellet de células. Este é enxertada embaixo da cápsula renal em um mouse imunodeficientes. Sómente 2,5 x 10<sup&gt; 5</supHESCs&gt; são necessários para formar um 16 cm<sup&gt; 3</sup&gt; Teratoma dentro de 8-12 semanas. O destino do hESCs originalmente selecionado pode então ser determinado por imunohistoquímica. Este método fornece uma ferramenta valiosa para a caracterização de tecidos específicos reagentes para celular baseado em terapia.

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Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Diferenciação dirigida de hESCs em células específicas tem gerado muito interesse na medicina regenerativa. Nós fornecemos uma concisa, protocolo passo a passo para determinar a<em&gt; In vivo</em&gt; Destino de hESCs selecionados que proporciona uma ferramenta valiosa para a caracterização de tecidos específicos reagentes para celular baseado em terapia.

Mapeamento de destino de células estaminais embrionárias humanas por formação de teratomas

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

fate-mapping-of-human-embryonic-stem-cells-by-teratoma-formation

Research

JoVE Journal

Biology

17.0K visualizações.  University of California San Francisco. Diferenciação dirigida de hESCs em células específicas tem gerado muito interesse na medicina regenerativa. Nós fornecemos uma concisa, protocolo passo a passo para determinar a In vivo Destino de hESCs selecionados que proporciona uma ferramenta valiosa para a caracterização de tecidos específicos reagentes para celular baseado em terapia.

Vídeo: Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Propagação de-tronco embrionárias humanas (ES) Células

Biologia

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Derivação de células estaminais embrionárias humanas por Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

Sondagem para a Atividade Complexo mitocondrial em células estaminais embrionárias humanas

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Cromatina imunoprecipitação de células estaminais embrionárias humanas

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

Na rotulagem in vitro de células estaminais embrionárias humanas para Ressonância Magnética

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

Cultura e Manutenção de células estaminais embrionárias humanas

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

Preparação Spread cromossômica de células estaminais embrionárias humanas para Cariotipagem

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congelamento e descongelamento, células estaminais embrionárias humanas

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Diferenciação de células-tronco embrionárias em precursores oligodendroglial

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...