Les auteurs tiennent à remercier le GWU Harlan bourse de soutien de Paaqua Grant et le GWU Luther Rice bourse de soutien de Mona Herold. Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation subvention MCB-1121711.

1. Préparation des instruments, de la Culture et des Médias Plats <ol><li> Aiguisez quatre pinces à l&#39;aide de film abrasif d&#39;alumine. Pour ce faire, sous un microscope à dissection pour contrôler la taille de la pointe. Une paire de pince sert de back-up au cas où un embout est endommagé lors de la procédure. Autoclaver les quatre pinces et conserver dans un contenant stérile. </li><li> Assurez 500 ml de milieu de culture 0,1 X 1,0 X et (que ce soit Sonneries Marc jour [MMR] ou modification de Barth Saline [MBS]; recettes à 15) et le filtre à stériliser. Nous utilisons régulièrement MBS (1X = 88 mM de NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM de CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 5 mM d&#39;HEPES [pH 7,8], 2,5 mM NaHCO 3). Entreposer à 14-18 ° C pendant plusieurs mois. </li><li> Faire une solution à 2% d&#39;agarose dans un milieu de culture (2 g d&#39;électrophorèse d&#39;agarose de qualité dans 100 ml de milieu de culture 1X dans une bouteille en verre bouchon à vis). Autoclaver à dissoudre l&#39;agarose. Cela peut être conservé à 4 ° C pendant des mois, et au micro-ondes pour liquéfier la gélose lors de sa prochaine nécessaire. </li><li> Alors que l&#39;agarose est liquide, verser environ 0,5 ml sur le fond de chaque puits d&#39;une plaque de culture de 24 puits stérile. Cela permettra d&#39;éviter les explants de coller au plastique. </li><li> Alors que l&#39;agarose est liquide, verser environ 2-3 ml sur le fond de deux à trois boîtes de Pétri de 60 mm, et agiter doucement pour s&#39;assurer que le fond est couvert. Ils serviront de plats de dissection et l&#39;empêche d&#39;agarose embryons de coller à la fois les membranes en matière plastique sont retirés. </li><li> Lorsque la gélose a refroidi et durci, la flamme de la pointe d&#39;une pipette 6 &quot;Pasteur jusqu&#39;à ce qu&#39;il fonde en boule, et légèrement toucher à la surface de la gélose dans chaque puits de la plaque de culture. Cela va créer une dépression peu profonde dans laquelle l&#39;explant sera placé. </li><li> Remplir chaque puits de la plaque de culture avec 1X milieu de culture stérile. </li><li> Lorsque la gélose a refroidi et durci, remplissez le plat dissection avec un milieu de culture diluée (0,1 X 0,1 X MMR ou MBS) pour faciliter la séparation de blastomères. </li&gt; </ol> 2. Sélection des embryons <ol><li> Obtenir des œufs fécondés et enlever le manteau de gelée selon les protocoles standard de 15. Les transférer à 0.5X milieu de culture dans une boîte de Petri de 100 mm. </li><li> Lorsque les embryons atteignent le stade 2-cellules, trier ceux dans lesquels le sillon premier clivage divise la zone légèrement pigmenté dans l&#39;hémisphère animal (figure 1) dans un plat à part. Ce seront les bailleurs de fonds pour les explants. Gardez le reste des 2-cellules d&#39;embryons dans un plat séparé à côté des embryons donateurs tout au long de la procédure pour servir de témoins frères et sœurs de mettre en scène les explants. </li></ol> 3. Préparation des explants <ol><li> Placez embryons 5-10 dans un plat de dissection, mais ne fonctionne que sur un seul embryon à la fois. </li><li> Positionner le premier embryon de sorte que la membrane vitelline transparent on peut le voir, il est séparé par un espace libre (espace périvitellin) au-dessus de la surface du pôle animal de l&#39;embryon. En utilisant une force aiguiséps dans la main sous-dominante (la main gauche si on est droitier), saisissez la membrane vitelline au-dessus de l&#39;espace périvitellin. En utilisant une pince aiguisée dans l&#39;autre main, saisir la membrane proche de la première pointe pince et tirez doucement dans des directions opposées à peler la membrane de suite. Faire la saisie initiale à une distance à partir de la cellule qui doit être découpé, de sorte que la cellule cible n&#39;est pas endommagé lors du retrait de la membrane. On peut dire que la membrane a été supprimé parce que l&#39;embryon va aplatir. </li><li> Saisir une cellule voisine avec la pince à la main et sous-dominante d&#39;utiliser cette cellule comme une &quot;poignée&quot; si la cellule doit être découpé n&#39;est pas directement touchée. Avec la pince dans l&#39;autre main, tirez doucement sur les cellules restantes voisins loin du blastomère désiré. Si les cellules médianes, qui partagent le même sort, sont ciblés, ils peuvent être enlevés ensemble comme une paire. Enfin, disséquer l&#39;écart de la «poignée» de cellules. </li><li> Décrochez le blastomère (ou une paire blastomère), avec une solution stérile, Pipette Pasteur en verre, en évitant les bulles d&#39;air et d&#39;aspiration excessive. La pipette peut être polie au feu pour éliminer les bords coupants qui pourraient endommager la cellule, mais nous ne sommes pas systématiquement faire. Placer la pointe de la pipette Pasteur sous la surface du milieu de culture dans un puits de la boîte de culture d&#39;explant, et doucement expulser le blastomère. Il doit glisser dans la dépression peu profonde par gravité. Le blastomère même de plus d&#39;un embryon peuvent être combinés en un seul explant. </li><li> Répétez cette procédure avec les embryons restants dans le plat de dissection, un par un. Après environ 10 embryons, le plat de dissection sera rempli de débris cellulaires. Lorsque cela se produit, changez pour un plat de dissection douce. </li><li> Après toutes les dissections sont faites, vérifiez si les explants sont dans les dépressions peu profondes. Sinon, ils peuvent être doucement poussée dans la dépression avec une boucle de cheveux qui a été stérilisé dans de l&#39;éthanol 70% et séché à l&#39;air. </li><li> Environ une heure après la dissection dernière, enlever les débris surrounding les explants guéris avec une solution stérile, une pipette Pasteur en verre. </li><li> Culture de la plaque d&#39;explants à 14-20 ° C à côté de la boîte de Pétri contenant de la fratrie, embryons témoins. Embryons frères et sœurs indiquera le stade de développement des explants blastomères. </li></ol> 4. Les explants de récolte pour l&#39;analyse <ol><li> Récolter les explants lorsque les frères et sœurs atteindre le stade de développement souhaité. Ces explants survivent très bien, même si certaines des cellules se désintégrer. Par conséquent, s&#39;il ya une masse nuageuse dans le puits de culture, l&#39;explorer avec une boucle de cheveux ou une pince pour déterminer si un explant de santé est enterré à l&#39;intérieur. </li><li> Procurez-vous des explants dans un petit volume de solution de culture avec une pipette Pasteur en verre, et doucement les expulser dans un tampon de lyse approprié fixateur ou pour le dosage à effectuer. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+maternal+influences+on+dorsal-ventral+fate+of+Xenopus+animal+blastomeres.">Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres.</a> Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Development+of+Xenopus+laevis.">Early Development of Xenopus laevis.</a> A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcortical+rotation+in+Xenopus+eggs:+an+early+step+in+embryonic+axis+specification.">Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification.</a> Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).</li><li>Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+A:+Solutions+and+Protocols.">Appendix A: Solutions and Protocols.</a> Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).</li><li>Klein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+cleavage+furrow+demarcates+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos.">The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos.</a> Dev. 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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les étapes les plus importantes pour la culture réussie des blastomères individuels sont les suivants: 1) identifier correctement le blastomère d&#39;intérêts; 2) le maintien d&#39;un stérile, culture saine; 3) les cellules de dissection à la partie appropriée du cycle cellulaire, et 4) l&#39;élaboration du manuel nécessaire dextérité pour éviter des dommages lors de la dissection et de transférer à la culture bien. Pour manipuler blastomères spécifiques, il est essentiel d...

Xenopus laevis embryons ont été utilisés à grande échelle pour identifier les mécanismes par lesquels les cellules embryonnaires acquérir leurs destins particuliers parce que leurs œufs sont assez grands pour permettre des approches de microchirurgie. En outre, ils développent l&#39;extérieur sans la nécessité d&#39;une supplémentation nutritionnelle du milieu de culture, parce que chaque cellule contient une alimentation riche intracellulaire de plaquettes vitellines qui fournissent un accumulateur d&#39;énergie intrinsèque. Un atout important pour l&#39;étude des mécanismes par lesquels le destin des cellules est déterminée est l&#39;ensemble complet de cartes sort des blastomères stade de division (à partir de 2 - à 32 cellules étapes) 1, 2, 3, 4, 5, 6. Ces cartes ont été construits par micro-injection d&#39;une molécule détectable en un seul blastomère identifiables et suivi plus tard dans le développement de tissus qui sont peuplées par les descendants étiquetés. Les cartes compatibles sont destin possible parce que les axes cardinaux des embryons peuvent être identifiés de façon fiable dans de nombreux embryos. Tout d&#39;abord, dans tous les embryons de type sauvage de l&#39;hémisphère animal est pigmenté, alors que l&#39;hémisphère végétatif est pas. Deuxièmement, l&#39;entrée des spermatozoïdes lors de la fécondation provoque une contraction de la pigmentation hémisphère animal vers le côté ventral avenir, dans de nombreux embryons une différence de pigmentation peuvent donc être utilisés pour discriminer entre les côtés dorsal et ventral. En troisième lieu, le premier sillon de clivage se rapproche du plan médian sagittal dans la plupart des embryons, et peut donc être utilisée pour identifier les bords droit et gauche de l&#39;embryon. Les cartes sort aussi compter sur le fait que, naturellement, les oeufs fécondés fréquemment fendra par des motifs réguliers qui font que chaque blastomère identifiable à travers une large population d&#39;embryons. Alors il existe une variabilité au sein et entre les couvées d&#39;œufs sur des patrons de pigmentation et le décolleté, en utilisant les procédures de sélection décrite ici permet cellules avec des destins prescrites pour être identifié avec environ 90% de précision. Destins cellulaires peuvent être dissuader lesextrait au cours de l&#39;embryogenèse par plusieurs mécanismes. Les facteurs intrinsèques, tels que différemment héritées des ARNm cytoplasmiques ou des protéines, contribuent à plusieurs aspects de la structuration précoce. Par exemple, certains ARNm maternels déterminer les cellules qui contribuent à la lignée germinale, devenu l&#39;endoderme, ou de contribuer à l&#39;axe du corps dorsale (pour revue 7). Les facteurs extrinsèques fournis localement par les cellules voisines ou plus lointainement à partir d&#39;un centre embryonnaire de signalisation, sont responsables de l&#39;induction types spécifiques de tissus et de motifs presque tous les systèmes d&#39;organes. Exemples de centres de signalisation incluent l&#39;organisateur / noeud dans la gastrula qui induit l&#39;ectoderme neural et les modèles du mésoderme, et la zone d&#39;activité polarisante que les modèles de l&#39;axe antéro-postérieur du bourgeon de membre. Bien que les cartes destin d&#39;identifier les précurseurs des différents organes et de révéler la voie du développement pris par leurs descendants dans l&#39;embryon normal, ils ne peuvent pas distinguer intrinsèqueet les influences extrinsèques sur ces cellules. Ils ont également ne pas révéler le plein potentiel de développement d&#39;une cellule, dont les descendants se différencier dans l&#39;environnement complexe de signalisation de l&#39;embryon. Deux approches expérimentales pouvez tester si le destin d&#39;une cellule est déterminée par des facteurs intrinsèques ou est ensuite influencée par des facteurs externes: 1) la transplantation de la cellule à un emplacement roman dans l&#39;embryon, ou 2) la suppression de la cellule de l&#39;embryon suivie par la culture dans l&#39;absence de signaux exogènes. Les deux approches expérimentales ont été faisable chez Xenopus parce que les cellules sont assez grands pour être séparé manuellement. Par exemple, de nombreuses études ont supprimé des cellules individuelles à partir d&#39;embryons (pour changer interactions cellule-cellule) ou des cellules transplantées à des endroits nouveaux dans les embryons d&#39;accueil pour tester les modifications sort (commentaire en 7, 8, 9). En outre, la seconde approche de l&#39;explantation de petits nombres de cellules de différentes régions de l&#39;embryon iculture nto d&#39;élucider les interactions inductives tissulaires en l&#39;absence de facteurs exogènes est possible parce que les cellules de l&#39;embryon de Xenopus sont remplis d&#39;un magasin intracellulaire des nutriments, les plaquettes vitellines. Par conséquent, elles peuvent être cultivées pendant quelques jours dans un milieu défini sans sel supplémentation nutritionnelle ou facteur de croissance du milieu de culture. Nous avons utilisé cette approche pour montrer que les blastomères animaux dorsales ont une capacité autonome pour produire des neurones et des tissus mésodermiques dorsales dues à hérité de la mère ARNm 10, 11, et d&#39;autres ont montré que la spécification du mésoderme de 32 cellules blastomères s&#39;appuie à la fois sur l&#39;information intrinsèque et extrinsèque 12 . Un avantage de la culture de cellules comme explants, c&#39;est que le milieu peut également être complétée par des facteurs de signalisation définis afin de déterminer quelle cellule-à-cellule voie de communication pourrait influer sur le sort de la cellule explanté 12, 13, 14. En outre, on peut injecter le pr blastomèreIOR de culture avec de l&#39;ARNm de surexprimer un gène, ou par des oligonucléotides anti-sens pour prévenir la traduction des ARNm endogènes. Ceux-ci, gain et perte de fonction des analyses permettent d&#39;identifier les molécules sont nécessaires pour un destin autonome exprimé. Pour analyser le sort de l&#39;explant, l&#39;identification des types cellulaires spécifiques peuvent être effectuées par l&#39;expression des gènes standard (par exemple, l&#39;hybridation in situ, RT-PCR) et des tests immunocytochimiques. Ce protocole fournit un moyen simple, mais puissant, moyen de distinguer entre les mécanismes intrinsèques et extrinsèques qui régissent la façon dont une cellule embryonnaire se développe dans des tissus spécifiques.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Alumine film abrasif </td><td> Thomas Scientific </td><td> # 6775E-38 </td><td> Cours (12 um), pour des réparations majeures des extrémités de la pince </td></tr><tr><td> Alumine film abrasif </td><td> Thomas Scientific </td><td> # 6775E-46 </td><td> Moyen (3 um), pour bien aiguiser des extrémités de la pince </td></tr><tr><td> Alumine film abrasif </td><td> Thomas Scientific </td><td> # 6775E-54 </td><td> Fine (0,3 um), pour le polissage des extrémités de la pince </td></tr><tr><td> Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie N ° 5 </td><td> Outils Fine Science </td><td> # 11252-30 </td><td> Celles-ci ont les pointes fines qui n&#39;ont pas besoin d&#39;affûtage lors de la première acquisition. Résistant à la corrosion afin qu&#39;ils puissentêtre autoclavés. </td></tr><tr><td> Solution de gentamicine </td><td> Sigma </td><td> G1397 </td><td> Ajouter à moyenne le même jour que l&#39;utilisation </td></tr></tbody></table>

blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development

Cartes Destin, construits à partir de la lignée de traçage de toutes les cellules d&#39;un embryon, qui révèlent les tissus descendent de chaque cellule de l&#39;embryon. Bien que les cartes destin sont très utiles pour identifier les précurseurs d&#39;un organe et pour élucider la voie de développement par lequel les cellules descendants peuplent cet organe dans l&#39;embryon normal, ils n&#39;illustrent pas le plein potentiel de développement d&#39;une cellule précurseur ou d&#39;identifier les mécanismes par lesquels son sort est déterminé. Pour tester la volonté du destin cellulaire, on compare répertoire normal d&#39;une cellule de descendants dans l&#39;embryon intact (la carte sort) avec ceux qui sont exprimés après une manipulation expérimentale. Est le destin de la cellule fixe (engagé), indépendamment de l&#39;environnement cellulaire, ou est-elle influencée par des facteurs externes fournis par ses voisins? En utilisant les cartes complètes sort de l&#39;embryon de Xenopus, nous décrivons comment identifier, d&#39;isoler et de culture simples précurseurs stade de division, appelée blastomeres. Cette approche permet d&#39;évaluer si ces premières cellules se sont engagés à le devenir qu&#39;ils acquièrent dans leur environnement normal de l&#39;embryon intact, nécessitent des interactions avec leurs cellules voisines, ou peut être influencée à exprimer destins alternatifs s&#39;ils sont exposés à d&#39;autres types de signaux.

La capacité de ce test pour évaluer précisément le potentiel de développement de la cellule repose sur la dissection sur le blastomère correcte basée sur le sort des cartes 1, 2, 3, 4, 5, 6. Par conséquent, il est essentiel de choisir des embryons avec le motif de la pigmentation correcte au stade 2-cellules, comme illustré à la figure 1, qui par la suite se conformer aux habitudes régulières de clivage, comme l&#39;illustre la figure 2. Si l&#39;on observe les em...

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Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Le destin d&#39;une cellule individuelle embryonnaire peut être influencé par des molécules héréditaires et / ou par des signaux provenant des cellules voisines. L&#39;utilisation de cartes sort de l&#39;embryon de Xenopus clivage stade, blastomères simples peuvent être identifiés pour la culture en vase clos pour évaluer les contributions des molécules héritées par rapport interactions cellule-cellule.

Les explants blastomères à l&#39;essai pour l&#39;engagement du destin cellulaire au cours du développement embryonnaire

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

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15.2K vues.  The George Washington University. Le destin d'une cellule individuelle embryonnaire peut être influencé par des molécules héréditaires et / ou par des signaux provenant des cellules voisines. L'utilisation de cartes sort de l'embryon de Xenopus clivage stade, blastomères simples peuvent être identifiés pour la culture en vase clos pour évaluer les contributions des molécules héritées par rapport interactions cellule-cellule.

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Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

Culture et entretien des cellules souches embryonnaires humaines

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

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Biologie

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congélation et de décongélation cellules souches embryonnaires humaines

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

Une approche pratique de la cartographie inductible destin génétique: un guide visuel à Mark et Track Cellules In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Vidéo analyse bioinformatique des droits de croissance de la tige colonie de cellules embryonnaires

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Une approche de génétique inverse pour tester redondance fonctionnelle pendant l&#39;embryogenèse

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Cartographie sort des cellules souches embryonnaires humaines par la formation de tératome

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Simple cartographie du destin cellulaire chez le poisson zèbre

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

Un système d&#39;<em&gt; Ex vivo</emLa culture&gt; de pancréas embryonnaire

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and organs1,2,6,7. During development, toxic chemicals or genetic alterations can cause an increase in PCD or change PCD patterns resulting in developmental abnormalities and birth defects3-5. To understand the etiology of these defects, the study of embryos can be complemented with in vitro assays that use differentiating embryonic stem (ES) cells.
Apoptosis is a well-studied form of PCD that involves both intrinsic and extrinsic signaling to activate the caspase enzyme cascade. Characteristic cell changes include membrane blebbing, nuclear shrinking, and DNA fragmentation. Other forms of PCD do not involve caspase activation and may be the end-result of prolonged autophagy. Regardless of the PCD pathway, dying cells need to be removed. In adults, the immune cells perform this function, while in embryos, where the immune system has not yet developed, removal occurs by an alternative mechanism. This mechanism involves neighboring cells (called "non-professional phagocytes") taking on a phagocytic role-they recognize the 'eat me' signal on the surface of the dying cell and engulf it8-10. After engulfment, the debris is brought to the lysosome for degradation. Thus regardless of PCD mechanism, an increase in lysosomal activity can be correlated with increased cell death.
To study PCD, a simple assay to visualize lysosomes in thick tissues and multilayer differentiating cultures can be useful. LysoTracker dye is a highly soluble small molecule that is retained in acidic subcellular compartments such as the lysosome11-13. The dye is taken up by diffusion and through the circulation. Since penetration is not a hindrance, visualization of PCD in thick tissues and multi-layer cultures is possible12,13. In contrast, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analysis14, is limited to small samples, histological sections, and monolayer cultures because the procedure requires the entry/permeability of a terminal transferase.
In contrast to Aniline blue, which diffuses and is dissolved by solvents, LysoTracker Red DND-99 is fixable, bright, and stable. Staining can be visualized with standard fluorescent or confocal microscopy in whole-mount or section using aqueous or solvent-based mounting media12,13. Here we describe protocols using this dye to look at PCD in normal and sonic hedgehog null mouse embryos. In addition, we demonstrate analysis of PCD in differentiating ES cell cultures and present a simple quantification method. In summary, LysoTracker staining can be a great complement to other methods of detecting PCD.

We present a simple protocol to visualize regions of programmed cell death (PCD) in mouse embryos and differentiating embryonic stem (ES) cell cultures using a highly soluble dye called LysoTracker.

L&#39;utilisation de Lysotracker pour détecter la mort cellulaire programmée dans les embryons et la différenciation des cellules souches embryonnaires

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Suivi cellule à l&#39;aide protéines photoconvertible cours de développement poisson zèbre

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...