Diese Arbeit wurde durch ein umfassendes Research Grant aus dem California Institute for Regenerative Medicine (RC1-00104), eine Public Health Service Grant (HL085377) aus NHLBI, und ein Geschenk aus dem Pollin-Stiftung unterstützt HSB

Die schriftliche Protokoll unten auf der veröffentlichten Parametern von den Autoren berichteten, mit einigen Änderungen auf. Das Protokoll ist mit der Genehmigung durch die UCSF Institutional Animal Care und Use (IACUC) und Stammzellforschung Oversight (scro) Ausschüsse durchgeführt. I. Kultur von humanen embryonalen Stammzellen (hES) <ol><li> Wachsen hESCs in Standard-6-well (3,5 cm Durchmesser Brunnen)-Platten. </li><li> Mindestens 12 Stunden vor der Passage Zellen, Samen embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF, erhalten ab CF1 Tag E12.5 timed-gepaart Mäuse, bei 1000 Ci bestrahlt) Feeder-Zellen auf Platten mit 1% Gelatine (6,7) beschichtet. MEFs sollte bei 50-60% Konfluenz oder 4 beschichtet werden x 10 5 Zellen pro 3,5 cm Durchmesser gut (Abbildung 1). </li><li> Passage-Zellen, wenn Kolonien haben ~ 70% Konfluenz (Abbildung 2) erreicht. </li><li> Um Passage der Zellen, absaugen KSR Wachstumsmedium (6) aus den Vertiefungen und ersetzen mit 0,5 ml Medium mit Collagenase IV in KSR bei einer Konzentration von 1 mg / ml. </li><li> Die Platten mit Collagenase IV bei 37 ° C / 5% CO 2 für 5 Minuten oder bis Rändern der Kolonien beginnen, von der Platte zu heben. </li><li> Entfernen Collagenase IV von der Platte, 0,5 ml KSR in jede Vertiefung und manuell kratzen Zellen vollständig von der Platte zu entfernen. </li><li> Sammeln Sie die Zellsuspension aus jeder Vertiefung, in einem 15 ml konischen Rohr, und erlauben Zellen durch die Schwerkraft für 5 Minuten ruhen lassen. </li><li> Entfernen Sie den Überstand aus der Röhre, so dass die Zellen und Medium in einem Gesamtvolumen von ~ 300μl. </li><li> Mit einem 200 ul Mikro-Pipette eingestellt bei voller Lautstärke, sanft Pipette die Zellsuspension 5-6 mal die Auflösung der Kolonien. </li><li> Bringen Sie die Zellsuspension auf ein Gesamtvolumen von 9 ml pro Original gut von Zellen mit KSR Medium (dh, wenn man gut ist, geerntet werden, sollte das Röhrchen 9 ml enthalten). Supplement das Medium mit rekombinanten humanen basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) auf eine Konzentration von 12,5 ng / ml. </li><li> Nach dem Waschen der neue Brunnen mit MEF-Zellen (siehe Punkt 2) mit Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS), um alle Serum zu entfernen, 3 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Ändern KSR Medium mit bFGF 24 Stunden nach dem Durchgang, und jeder 24-48 Stunden, bis die Zellen bereit, wieder passagiert werden. </li></ol> II. Vorbereitung der hESC Pellet für die Transplantation <ol><li> Nach 24 Stunden vor der Transplantation, fügen ROCK-Inhibitor, die KSR Medium bis zu einer Endkonzentration von 10 um, um die Lebensfähigkeit der Zellen (8) zu erhöhen. Ein gut von Zellen bei ~ 70% Konfluenz (5 x 10 5 Zellen) erzeugt zwei Pellets, mit zwei Pellets pro Nierenkapsel eingefügt. </li><li> Zur Vorbereitung Zellpellets für die Transplantation (9), inkubieren ROCK-Inhibitor-behandelten Kulturen mit Collagenase IV für 5 Minuten bei 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Saugen Sie die Collagenase IV aus dem Brunnen und ersetzen mit 1 ml DPBS mit 10% Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep). </li><li> Manuelles kratzen die Kolonien von der Platte, spülen Sie die auch mit einer zusätzlichen 1 ml DPBS mit Pen / Strep, und übertragen jeweils 1ml Aliquot der Zellsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Spin Mikrozentrifugenröhrchen kurz bei 8.000 x g, saugen Sie den Überstand und resuspendieren die Pellets in 500μl DPBS mit Pen / Strep. </li><li> Um binden die Zellen für die Transplantation zusammen, fügen Sie 100 &amp;mgr; 1 mg / ml Phaseolus vulgaris Lectin (PHA) in DPBS in jedes Röhrchen. </li><li> Inkubieren der Zelle / PHA-Suspension bei Raumtemperatur für 5 Minuten, dann für 2 Minuten bei 8.000 x g Spin. Drehen der Rohre um 180 ° in ihrem Rotor Brunnen und Spin wieder für 2 Minuten bei 8.000 x g. </li><li> Vorsichtig absaugen Überstand Verlassen des Pellet intakt. </li><li> Verdrängen die Zellpellets aus den Röhrchen durch vorsichtiges Pipettieren 200 ul KSR neben dem Rand des Pellet, bis sie hebt langsam. </li><li> Sobald verdrängt, sofort in den Pellets zu 0.4μm Millicell Einsätze in 3,5 cm Durchmesser Brunnen mit 3 ml KSR gelegt, und inkubieren für 2 Stunden bis über Nacht bei 37 ° C / 5% CO 2. </li></ol> III. Nierenkapsel Pfropfen <ol><li> Führen Sie alle tierischen Verfahren in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts unter angemessenen aseptischen Bedingungen. </li><li> Anesthetize SCID beige Mäusen (CB17.Cg-Prkdc scid Lyst bg / CRL), im Alter von 8-12 Wochen, mit einer Kombination von inhalativen 3% isoflurane/0.5% O2 und intraperitonealer Tribromethanol (Avertin, 25 mg / kg frisch zubereitet). Zwei Zellpellets pro Maus eingepflanzt Verwendung beschriebenen Techniken (10) werden. </li><li> Nach der Platzierung der Maus auf ein Heizkissen, um eine Unterkühlung zu verhindern, rasieren Bereich des Einschnitts, dann desinfizieren mit Chlorhexidin. Machen Sie einen 2,5 cm Schnitt durch die Haut nur aus der Mitte, sondern parallel zur Wirbelsäule. </li><li> Keeping the Einschnitt Bereich feucht mit steriler saline, einen kleineren Schnitt durch den Muskel, gerade unterhalb der Rippen und ~ 1 cm von der Wirbelsäule. Der Schnitt sollte gerade groß genug, um die Niere durch zu ziehen, aber klein genug, dass die Niere wird nicht wieder in die Bauchhöhle ohne Gewalt. </li><li> Ziehen Sie die Niere vorsichtig durch den Muskel Schnitt mit einem Glas Pasteur Pipette, die in der Form eines stumpfen, leicht gebogene Haken gezogen worden ist. </li><li> Wet die Niere mit steriler DPBS, um die Kapsel vor dem Austrocknen zu verhindern. Dies kann notwendig sein, um während des gesamten Verfahrens zu wiederholen, als die Kapsel ist sehr zerbrechlich. </li><li> Mit Dumont Nr. 5 Pinzette vorsichtig die Kapsel aus der Niere und eine 2 mm Schnitt mit Vannas Frühjahr Schere. </li><li> Mit einem weiteren Glaspipette, die in eine sehr feine, stumpfe Sonde gezogen worden ist, machen Sie eine kleine Tasche zwischen der Kapsel und der Niere. </li><li> Mit einer großen Blende Pipettenspitze auf einem Einweg-Transferpipette platziert, nehmen Sie eine einzelne Zelle Pellet aus der Millicell einzufügen. Achten Sie darauf, möglichst wenig zusätzliche Medien zusammen wie möglich, wie überschüssige Medien mit dem Pellet Übertragung stören können. </li><li> Halten Sie den Rand des Einschnitts, um die Tasche zu schaffen, ganz sanft das Pellet neben der Öffnung und schieben Sie sie in die Tasche zu einem Pol der Niere mit der Pipette gezogen. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang mit einem zweiten Pellets. Legen Sie diese unter der Kapsel der gleichen Niere, sondern auf dem entgegengesetzten Pol. </li><li> Vorsichtig die Kapsel zurück auf die Pellets. Die Pellets sollen in der Tasche bleiben, und keine Nähte erforderlich sind, um die Kapsel zu schließen. </li><li> Schieben Sie die Niere wieder in die Bauchhöhle und in der Nähe des Muskels Wand mit 4-0 Seidenfäden (oder kleiner) mit angeschlossenem Reverse-Schneidnadel. Der Schnitt sollte so klein sein, dass nur eine einzige Naht notwendig ist. </li><li> Schließen Sie die Haut mit einer Reihe von 4-5 unterbrochen Stiche, mit dem gleichen Nahtmaterial. </li><li> Bevor Sie mit der Maus zurück in seinen Käfig, verwalten 0,05 mg / kg Buprenorphin (11,12) und 5 mg / kg Ketoprofen (12,13) ​​als kurzfristige und langfristige Analgetika bzw.. Geregelte Stoffe dürfen nur in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts verwendet werden. </li><li> Übertragen Sie die Tiere wieder in seinen Käfig und lassen Sie sie aus der Narkose auf einem Heizkissen erholen. Dies sollte etwa 20-30 Minuten in Anspruch nehmen. </li><li> Sobald die Maus ist voll gehfähig, kann es für das Tier Wohnanlage zurückgegeben werden. </li></ol> IV. Teratom Ernte, Fixierung und Schneiden <ol><li> Bei 8-12 Wochen nach der Operation sollte es eine kaum spürbare Teratom in der Nähe der Niere. Large, mit Flüssigkeit gefüllte Zysten wird oft als gut entwickeln, beginnend bei 6-8 Wochen. Diese kann es erforderlich eine frühere Ernte, wenn sie Not, um das Tier zu verursachen. Da Teratome bei langsameren Raten als Zysten wachsen, jedoch werden Sie wollen so lange wie möglich warten, um ein Teratom von ausreichender Größe für die Analyse (dh mindestens 8 Wochen) zu erhalten. </li><li> Entfernen Sie die Niere, Teratom, und alle umliegenden Zysten als ein Block von Gewebe aus der Bauchhöhle mit der gleichen chirurgischen Ansatz, bei dem die Nieren ursprünglich zugegriffen wurde (siehe Abschnitt III, die Schritte 1-4 oben). </li><li> Platzieren Sie den gesamten Block von entfernten Gewebes in ein Röhrchen mit 10% gepuffertem Formalin. </li><li> Lassen Sie das Teratom über Nacht fix bei 4 ° C. </li><li> Am folgenden Tag, entfernen Sie das Teratom aus der Tube. Dissect weg keine Zysten und so viel Nieren wie möglich, ohne die Teratom selbst (Abbildung 3). Größere Teratome können in zwei Hälften geschnitten werden, um Dissektion und Einbettung zu erleichtern. </li><li> Prozess der Teratom mit einem Standard-Paraffin-Verfahren zur Fixierung. Automatisierte Geräte sind (zB Shandon Hypercenter): <table border="0"><tbody><tr><td> I. </td><td> 80% Flex Alkohol </td><td> 2 Stunden </td></tr><tr><td> II. </td><td> 80% Flex Alkohol </td><td> 1 Stunde </td></tr><tr><td> III. </td><td> 85% Flex Alkohol </td><td> 1,5 Stunden </td></tr><tr><td> IV. </td><td> 95% Flex Alkohol </td><td> 1 Stunde </td></tr><tr><td> V. </td><td> 100% Flex Alkohol </td><td> 1 Stunde </td></tr><tr><td> VI. </td><td> 100% Flex Alkohol </td><td> 1 Stunde </td></tr><tr><td> VII. </td><td> 100% Flex Alkohol </td><td> 1 Stunde </td></tr><tr><td> VIII. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> 1 Stunde </td></tr><tr><td> IX. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> 1 Stunde </td></tr><tr><td> X. </td><td> Clear-Rite 3 </td><td> 1 Stunde </td&gt; </tr><tr><td> XI. </td><td> Paraffin (TissuePrep) </td><td> 2 Stunden </td></tr><tr><td> XII. </td><td> Paraffin (TissuePrep) </td><td> 2 Stunden </td></tr></tbody></table></li></ol> V. Immunhistochemie und Analyse <ol><li> Einmal in Paraffin, Abschnitt der Teratom in 5 um serielle Scheiben mit einem Rotationsmikrotom und Float Schnitte auf Objektträgern eingebettet. </li><li> Vor der Färbung, backen die Folien für mindestens eine Stunde. </li><li> Stain die Folien mit Hämatoxylin und Eosin unter Verwendung von Standardverfahren, um Gewebestrukturen Vertreter jeder der drei embryonalen Keimblätter (Abb. 4) zu identifizieren: <table border="0"><tbody><tr><td> I. </td><td> Xylol waschen </td><td> 3-5 Minuten </td></tr><tr><td> II. </td><td> Xylol </td><td> 3-5 Minuten </td></tr><tr><td> III. </td><td> 100% Alkohol </td><td> 3-5 Minuten </td></tr><tr><td> IV. </td><td> 100% Alkohol </td><td> 3-5 Minuten </td></tr><tr><td> V. </td><td> 95% Alkohol </td><td> 3-5 Minuten </td></tr><tr><td> VI. </td><td> 80% Alkohol </td><td> 3-5 Minuten </td></tr><tr><td> VII. </td><td> Wasser waschen (mehrere Änderungen) </td><td> 2 Minuten </td></tr><tr><td> VIII. </td><td> Gill Hämatoxylin # 3 </td><td> 2-5 Minuten </td></tr><tr><td> IX. </td><td> Wasser waschen (mehrere Änderungen) </td><td> bis das Wasser klar </td></tr><tr><td> X. </td><td> Scott ist Wasser (blau Kerne) </td><td> 3 Minuten oder mehr </td></tr><tr><td> XI. </td><td> Wasser waschen (mehrere Änderungen) </td><td> 1-2 Minuten </td></tr><tr><td> XII. </td><td> Eosin Y </td><td> 1 Minute </td></tr><tr><td> XIII. </td><td> Wasser waschen (mehrere Änderungen) </td><td> 30 Sekunden </td></tr><tr><td> XIV. </td><td> 80% Alkohol </td><td> 1 Minute </td></tr><tr><td> XV. </td><td> 95% Alkohol </td><td> 2 Minuten </td></tr><tr><td> XVI. </td><td> 95% Alkohol </td><td> 2 Minuten </td></tr><tr><td> XVII. </td><td> 100% Alkohol </td><td> 3 Minuten </td></tr><tr><td> XVIII. </td><td> 100% Alkohol (clean) </td><td> 3 Minuten </td></tr><tr><td> XIX. </td><td> Xylol </td><td> 2 Minuten oder mehr </td></tr><tr><td> XX. </td><td> Xylol </td><td> 2 Minuten oder mehr </td></tr></tbody></table></li><li> Montieren Sie ein Deckglas auf jeder Folie mit Permount. </li></ol> VI. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Plating bestrahlter CF1 embryonalen Maus-Fibroblasten als Feeder-Schicht für die Kultivierung undifferenzierter hESCs. MEFs sind bei ~ 50% Konfluenz vernickelt, wie hier gezeigt, oder 4 x 10 5 Zellen pro 3,5 cm Durchmesser und in einer 6-well Kulturschale. Bar, 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Beispiel subkonfluenten Kultur von undifferenzierten hESCs auf einem MEF Feeder-Schicht. HESCs auf MEF Feederschichten bis ~ 70% konfluent gewachsen, wie hier gezeigt, dann passagiert, wie beschrieben. Bar, 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Beispiel explantierten Teratome. Nach der Explantation, die Teratom-, Nieren-und Zubehörteilen Gewebe als ein Block in Formalin fixiert, dann die Nieren-und Zubehör-Gewebe werden sorgfältig entfernt, bevor die Einbettung in Paraffin geschnitten. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Teratome aus undifferenzierten hESCs abgeleitet enthalten Gewebe Vertreter aller drei Keimblätter in vivo. Ein Teratom, wie in Abbildung 3 dargestellt, wurde geschnitten und gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin, embryonale Gewebe zu identifizieren. hESCs führen zu Gewebe aller drei embryonalen Keimblätter (Ektoderm (A, B), Mesoderm (C), Endoderm abgeleitet (D). (A) Nascent Neuralrohr Struktur. (B) Primitive Plattenepithel. (C) Knorpelschäden Kapsel der kondensierten Mesenchym umgeben. (D) Glandular Darm-Struktur. Bar, 100 um. Bilder mit freundlicher Genehmigung des Autors abgedruckt. <img src="/files/ftp_upload/2036/2036fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Teratom Analyse kann verwendet werden, um das Schicksal der markierten, undifferenzierte hES Karte sein. Wie bereits veröffentlicht (9), eine Mischung aus speziell markiert hESCs mit untagged hESCs verwendet werden, um das Schicksal der markierten Zellen in ein Teratom-Assay Karte. Wie hier gezeigt wurden undifferenzierte hES Ausdruck der Oberfläche Marker CD133 und markiert mit Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP), mit untagged, undifferenzierte hES gemischt. Diese wurden verwendet, um Teratome von Nierenkapsel Pfropfen bilden. Immunhistochemische Analyse der Hämatoxylin und Eosin-gefärbten Teratom Abschnitte mit anti-eGFP-Antikörper zeigt die neuroektodermalen Schicksal der CD133 + hESCs. Teratome wurden wie in Abbildung 4 verarbeitet und gegengefärbt mit anti-eGFP-Antikörper (braun) zu lokalisieren Derivate von CD133 + GFP +-Zellen im Gewebe. CD133 +-abgeleiteten Zellen (Pfeile) wurden in den Geweben aus embryonalen Ektoderm, insbesondere neuronale Epithel (links) und im Entstehen begriffenen Neuralrohr-ähnlichen Strukturen (rechts) beobachtet. Bar, 100 um. Bilder mit freundlicher Genehmigung des Autors abgedruckt. Gelatine <ul><li> 0,1% Gelatine vom Schwein </li><li> 99,9% DPBS <ul><li> Add Gelatine DPBS, bei 37 ° C für eine Stunde oder bis alle Gelatine in Lösung geht und Filter sterilisieren (0,22 &amp;mgr; m) vor dem Gebrauch zu inkubieren. </li></ul></li></ul> MEF-Medium <ul><li> 10% fötalem Rinderserum (qualifiziert) </li><li> 90% Dulbecco Modified Essential Medium (D-MEM) </li><li> 1x L-Glutamin </li><li> 1x Pen / Strep <ul><li> Filter vor Gebrauch zu sterilisieren. </li></ul></li></ul> KSR (Knockout Serum Replacement) Medium <ul><li> 20% KnockOut Serum Ersatz </li><li> 80% KnockOut D-MEM </li><li> 1x L-Glutamin </li><li> 1x nicht essentielle Aminosäuren </li><li> 0,1 mM β-Mercaptoethanol / </li><li> 12,5 ng / ml bFGF <ul><li> Filter sterilisieren. </li><li> Lagerung bei 4 ° C, aber warm bis 37 ° C vor der Zugabe zu den Zellen. </li><li> Add bFGF unmittelbar vor dem Gebrauch. </li></ul></li></ul> Collagenase IV <ul><li> 1 mg / ml in KSR Medium, indem bei 37 ° C für 1-2 Stunden oder bis alle Pulver in Lösung geht. </li><li> Filter sterilisieren. </li></ul> Avertin <ul><li> 0,25 g 2,2,2-Tribromethanol </li><li> 0,25 ml 2-Methyl-2-Butanol <ul><li> Bei 37 ° C über Nacht auf 100% ig. </li><li> Einige Stunden vor der Operation, zu verdünnen, um 2,5% funktionierende Lösung mit DPBS und bei 37 ° C für mindestens 1 Stunde. </li><li> Filter sterilisieren und aliquote. </li><li> Tribromethanol ist sehr lichtempfindlich, so vor Licht zu schützen in allen Phasen der Herstellung und Verwendung. </li><li> Bereiten Sie nicht mehr als 12-24 Stunden vor dem Gebrauch. </li></ul></li></ul> Buprenorphin <ul><li> 1 mg / ml Stammlösung in Methanol <ul><li> Verdünnen auf 0,015 mg / ml Arbeitslösung mit sterilem H 2 O. </li><li> Lagerung bei -20 ° C bis zu 1 Monat. </li></ul></li></ul> Ketoprofen <ul><li> 0,5 mg / ml Arbeitslösung in DPBS <ul><li> Add DPBS inkubieren über Nacht bei 37 ° C für 1-2 Stunden oder bis alle Pulver in Lösung geht. </li><li> Filter sterilisiert und bei 4 ° C. </li></ul></li></ul>

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Wir haben eine hocheffiziente Teratom-Assay für die Zwecke der Kartierung das Schicksal der Differenzierung hESCs in einem In-vivo-Umgebung angepasst. Eine kleine Anzahl von speziell ausgewählten hESCs ist mit undifferenzierten Wildtyp hESCs und Phaseolus vulgaris Lectin ein Zellpellet vermischt. Dies ist unter der Nierenkapsel in einem immundefizienten Maus gepfropft. Das Schicksal der ursprünglich ausgewählten hESCs dann durch Immunhistochemie (Abbildung 5) bestimmt werden, wie bereits berichtet (9). Diese Methode bietet ein wertvolles Werkzeug für die Identifizierung und Generierung Gewebe-spezifische Reagenzien für zell-basierte Therapien.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2-Methyl-2-butanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>240486</td>
<td>Avertin</td>
</tr>
<tr>
<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T48402</td>
<td>Avertin</td>
</tr>
<tr>
<td>4-0 silk sutures</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>641G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>bFGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D Systems</td>
<td>233FB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Buprenorphine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>B7536</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clear-Rite 3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-046-341</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase IV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C5138</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11965</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dupont #5 forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>500233</td>
<td>Kidney capsule</td>
</tr>
<tr>
<td>Eosin Y</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>23-245-658</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (Qualified)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>26140-079</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flex alcohol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-046344</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gill&#x2019;s Hematoxylin #3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-050-204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hemostat, straight</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>501241</td>
<td>General surgery</td>
</tr>
<tr>
<td>Iris forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>15914</td>
<td>General surgery</td>
</tr>
<tr>
<td>Ketoprofen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>K2012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KnockOut D-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10829</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KnockOut Serum Replacement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10828-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25020-081</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MILLICELL inserts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>PICM01250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nonessential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11140-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Operating scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>501754</td>
<td>General surgery</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraffin (TissuePrep)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>8002-74-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Permount</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SP15-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PHA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>L1668</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Porcine gelatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>G6144</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ROCK inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>Y-27632</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SCID beige mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Charles River </td>
<td>250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scott&#x2019;s Wash</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>6697-32</td>
<td>Ricca Chemicals</td>
</tr>
<tr>
<td>Vannas spring scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>14003</td>
<td>Kidney capsule</td>
</tr>
<tr>
<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>M7522</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fate mapping of human embryonic stem cells by teratoma formation

Humane embryonale Stammzellen (hES) haben eine unbegrenzte Kapazität zur Selbsterneuerung und die Fähigkeit, sich in Zellen aller drei embryonalen Keimblätter (1) abgeleitet unterscheiden. Gerichtete Differenzierung von hES zu spezifischen Zelltypen hat viel Interesse im Bereich der regenerativen Medizin (z. B. (2-5)) erzeugt wird, und Methoden zur Bestimmung der<em&gt; In vivo</em&gt; Schicksal ausgewählt oder manipuliert hESCs sind unerlässlich, um dieses Unterfangen. Wir haben eine hocheffiziente Teratom-Assay für diesen Zweck hergerichtet. Eine kleine Anzahl von speziell ausgewählten hESCs ist mit undifferenzierten Wildtyp hESCs und Phaseolus vulgaris Lectin ein Zellpellet vermischt. Dies ist unter der Nierenkapsel in einem immundefizienten Maus gepfropft. So wenig wie 2,5 x 10<sup&gt; 5</sup&gt; HESCs sind nötig, um eine 16 cm Form<sup&gt; 3</sup&gt; Teratom innerhalb von 8-12 Wochen. Das Schicksal der ursprünglich ausgewählten hESCs kann dann durch Immunhistochemie bestimmt werden. Diese Methode bietet ein wertvolles Werkzeug für die Charakterisierung von Gewebe-spezifischen Reagenzien für zell-basierte Therapien.

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Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Gerichtete Differenzierung von hES-Zellen in spezifische hat viel Interesse in der regenerativen Medizin erzeugt. Wir bieten Ihnen eine präzise, ​​Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Bestimmung des<em&gt; In vivo</em&gt; Schicksal der ausgewählten hESCs, dass ein wertvolles Werkzeug für die Charakterisierung von Gewebe-spezifischen Reagenzien für zell-basierte Therapien zur Verfügung stellt.

Fate Mapping von humanen embryonalen Stammzellen durch Teratom Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

fate-mapping-of-human-embryonic-stem-cells-by-teratoma-formation

Research

JoVE Journal

Biology

17.1K Aufrufe.  University of California San Francisco. Gerichtete Differenzierung von hES-Zellen in spezifische hat viel Interesse in der regenerativen Medizin erzeugt. Wir bieten Ihnen eine präzise, ​​Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Bestimmung des In vivo Schicksal der ausgewählten hESCs, dass ein wertvolles Werkzeug für die Charakterisierung von Gewebe-spezifischen Reagenzien für zell-basierte Therapien zur Verfügung stellt.

Serie: Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Yeah, so I'm Lauren Deon. I'm in charge of the Human Amgen stem cell co facility at MGH. Yeah, so I'm Lauren, I'm in charge of the Human AM stem cell co facility at MGH.So I've been working with human Amgen stem cells for years now since I was a postdoc in George De Lab before, from four, four years. And so right now we have two cell lines, H one and H nine, which are both from Y cell. And so the way we are expanding or maintaining these cells in culture is by, at least the way we are splitting these cells is by using collagenous.So what I usually do is for the first few passage after throwing the cells, I use a technical, the picking colonies. So in this case, I can check under the microscope which colonies are good and differentiate and nice shape, and I will collect only these colonies and I will cut them in few pieces and put them back in, in a fresh flat. And the, the colonies that look kind of differentiate it are just left them alone.The other way to pass the cells is by using trypsin. So I don't use this technique here. I think collagenase is a little bit safer because human being stem cells don't like to be individualized or they don't like to be alone.So if you do trypsin, if you use trypsin for a little bit too long, if you use it for like three to four minutes, which is the way we use strips in for other type of cells, human stem cells will be individualized and most of them will die or just differentiate or will not attach to the myth. So the idea is you have to keep the cells as clumps. You don't want them to be alone in the in, in the flask.So using collagenase, the advantage is to keep cells as plants. Using chipsy, you just select for cells that will survive this very, very harsh process of g opsonization. So these cells are usually very highly proliferative.So you get, you can adapt your cells to this tripsin process. The problem is that you have cells that they behave differently, they go much faster. And one risk is that you can get some commercial abnormality to, to this, to this very high division process.So you say that ization can cause selection of cells in culture for most proliferative cells.Right. More ative and probably also higher survival rates than other cells. So after proliferation, basically culture after proliferation in tripsin, after several passages become a different culture, these different properties.So it's, it's hard to figure out if they are exactly identical. If you do the test, the usual test, let's say you check markers, regular markers of end differentiated cells like OC four, nano one 60 SC four C, C3, all this molecule might still be expressed. If you do TER formation, this cells might still differentiate and be formed like al like normal cells.If you look at the karyotype, you might have some abnormality, but you might still have a normal karyotype. The, the, the selective advantage might be due to just a mutation that you cannot see by doing a karyotype. So the fact that they grow much faster is by itself I think a little bit worser.And if we want to use these cells for transplantation at some point, I would definitely not use this type of cells.Okay. So would you like to tell me what are the main technical problems with using this technique for, for passages of cells? So using S, yes.It's just a little bit longer and also it's, since the cells are not going as fast, it's just much longer to get a high number of cells to do some experiment. So it's just less convenient I would say. Would you like to tell me about few words about the goals of your experiment?How do you use CS cells? Okay, so my main project here is to get endothelial cells from human AB stem cells. And the idea is to be able to make blood.And we are working a lot with tissue bioengineering labs and one of their goal is to make tissue in vitro. But one of the limitation to this is the lack of blood vessels going through this tissues. So if we can bring endothelial cells or put endothelial cells in this tissue, we would have better growth of this tissue.So the idea few sources of cells are known for endothelial cells like cold blood or pressure blood, but it would be interesting to have another source of cells like human years. And the advantage is since human years can be expanded and most infinitely, you could modify these cells, make some inducible system and be able to use it. Then in your final product, your material cells, in this case.

Vermehrung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen)

Forschung

Biologie

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

Probing für Mitochondriale komplexe Aktivität in humanen embryonalen Stammzellen

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

In-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen für Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

Kultur und Wartung von humanen embryonalen Stammzellen

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

Chromosomale Spread-Vorbereitung von humanen embryonalen Stammzellen für die Karyotypisierung

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Einfrieren und Auftauen humanen embryonalen Stammzellen

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...