Partie 1. Préparer la zone chirurgicale <ol><li> Si vous travaillez avec des réactifs biologiques dangereux (par exemple des vecteurs rétroviraux), la chirurgie doit être réalisée à l&#39;intérieur d&#39;une armoire de biosécurité II (CSB). Le microscope de rétrodiffusion ultrasonore (UBM) devraient s&#39;asseoir à côté de la BSC, avec le transducteur à l&#39;intérieur du BSC, et maintenu en place par un support moteur contrôlé sur une scène spécialement conçue chirurgicale. Les composants nécessaires pour construire le stade montré dans la vidéo sont répertoriés sur la ligne. Cette liste, avec des images de la scène sous plusieurs angles (disponible sur demande), devrait permettre la construction. </li><li> L&#39;ouverture et la fermeture de la laparotomie (intervention chirurgicale dans laquelle la cavité abdominale est à ciel ouvert pour permettre l&#39;accès aux organes internes) est habituellement réalisée sur un tampon absorbant avec support en plastique. Avant la chirurgie de tous les outils nécessaires (par exemple un rasoir, des ciseaux chirurgicaux, des pinces, chargé autoclip applicateur, etc), et des matériaux (par exemple du PBS, les sutures, l&#39;anesthésie, le titulaire de la souris et la plaque sus-jacente, etc) doivent être stérilisés et placés dans le zone chirurgicale. Limiter la quantité de temps l&#39;incision est ouvert est important pour optimiser les chances de succès à la chirurgie. Toutes les manipulations d&#39;animaux doit être effectué avec des gants qui ont été désinfectés avec MB-10 solution, ou l&#39;équivalent. Une désinfection répétée devrait être réalisée si nécessaire pour assurer que les gants sont stériles. </li></ol> Partie 2. L&#39;anesthésie de la souris <ol><li> Remplir une seringue de 1 cc de la solution anesthésique contenant une partie (50 mg / ml de pentobarbital) Nembutal à 4 parties filtrée stérilisée à 25 mg / ml de sulfate de magnésium dans du PBS. Cela se traduira par une solution qui est de 10 mg / ml de pentobarbital et 20 mg / ml de sulfate de magnésium. Chaque souris devraient être pondérés individuellement, et injectés avec 90 mg par kg de poids corporel pentobarbital (par exemple, une souris 28 g serait injecté avec 250 pi). </li><li> Injecter dans l&#39;abdomen (voie intrapéritonéale, IP) d&#39;une souris enceinte à jour embryonnaire (E) 9.5 (peut utiliser d&#39;autres âges que nécessaire) pénétrer la peau et les muscles abdominaux. Permettez 8-12 minutes pour la souris de devenir non-recevable. L&#39;anesthésie adéquate doit être confirmée par la posture décontractée de l&#39;animal, et le manque de mouvement en réponse à la queue et pincées orteil. Pinçant doucement entre les ongles est très sensible, et l&#39;absence de toute réponse à ces pincements indique que les animaux sont suffisamment anesthésiés. Remarque, même les animaux qui sont complètement insensibles aux pincements queue et pieds peuvent parfois contraction légèrement en réponse à l&#39;incision chirurgicale initiale. Cependant, ceci est une réponse réfléchie et n&#39;indique pas d&#39;anesthésie inadéquate. Baume ophtalmiques à base de pétrole devrait être appliqué sur les yeux de la souris pour éviter le dessèchement pendant la chirurgie. </li><li> Mise en place de la zone chirurgicale et la machine à ultrasons en attendant la souris pour devenir anesthésiés. Puisque l&#39;utilisation de rétrovirus ou lentivirus nécessite BSL2 de confinement, comme indiqué ci-dessus les injections virale doit être effectuée dans un cabinet de biosécurité II. En outre, toutes les solutions et les matériaux jetables qui entre en contact avec le virus doivent être décontaminés avec une solution javellisée à 10%. Les instruments chirurgicaux et appareils d&#39;échographie doivent être traitées avec une solution de stérilisation tels que MB-10 ( <a href="http://www.quiplabs.com/mb10.htm">http://www.quiplabs.com/mb10.htm</a> ), ou un équivalent utilisé par l&#39;installation en question. </li></ol> Partie 3. L&#39;exposition des embryons <ol><li> Si possible (selon les contraintes de l&#39;installation animal donné et l&#39;espace disponible), il est préférable d&#39;avoir l&#39;aire de préparation chirurgicale dans un endroit séparé de la zone chirurgicale. Cela permettrait de minimiser les chances de contamination croisée entre les animaux. Pour lancer l&#39;opération, placer l&#39;animal sur le dos sur une surface stérile absorbant et laver soigneusement la zone abdominale avec de l&#39;éthanol à 70%. Traitements préopératoire plus vaste peut être utilisé (par exemple, des cycles successifs de la Bétadine et des lavages éthanol à 70%), mais dans notre expérience, cela n&#39;est pas nécessaire pour ce type de chirurgie de survie des rongeurs. En utilisant une lame de rasoir à double tranchant, raser les poils de l&#39;abdomen dans une zone d&#39;environ 1 pouce de large et 1,5 cm de long. Utilisez courts mouvements rapides avec le rasoir à environ un angle de 45 °. Il est important que la zone chirurgicale être convenablement traitée, mais non soumis à un mouillage excessif, car cela peut entraîner refroidissement inutile de l&#39;animal, voire une hypothermie. </li><li> Utiliser beaux ciseaux chirurgicaux faire une une «incision longitudinale à travers la peau en premier, et ensuite à travers le muscle abdominal de l&#39;animal (coupage en traversant le tissu conjonctif de la peau détenant au muscle aidera à la deuxième incision). Notez que tout le soin procédure devrait être prises pour assurer que les outils chirurgicaux restent stériles, et le traitement avec un désinfectant doit être réalisée si nécessaire (c&#39;est à dire si les info-bulles sont en contact avec des non-sterile matériel). </li><li> En utilisant une pince attentivement tirer cornes utérines, et d&#39;enregistrer le nombre d&#39;embryons de chaque côté. Tout en laissant deux embryons exposés adjacentes (sélection dont deux dépendent de la configuration de chaque côté), placez la plupart des cornes utérines de retour dans l&#39;animal. Dans ce contexte, deux embryons seront exposés à un moment donné et baignés dans du PBS, tandis que la mère reste sur le dos. </li><li> Placez l&#39;animal sur son dos dans le support en plexiglas où il sera pendant la chirurgie (Figure1A) *. Ensuite, abaisser la boîte de culture de tissu de 10cm ** (qui doivent être désinfectés avec MB-10 avant de l&#39;utiliser) vers le bas sur la mère, avec une paire de pince placée légèrement à travers la membrane verte silastic (faite en utilisant le caoutchouc de silicone RTV L de base, et durcisseur, les numéros de produits Dow-Corning 3142761 2156946 et, respectivement). Comme vous le bas de la plaque vers le bas sur l&#39;animal, utilisez la pince pour saisir le tissu utérin entre les deux embryons à injecter, et doucement les tirer à travers la membrane. Dans le même temps, la plaque est abaissée complètement vers le bas sur le support, et les punaises sont poussés pour le maintenir en place. Pré-chauffé (à 37 ° C) PBS est ensuite ajouté à l&#39;antenne pour couvrir complètement les embryons. </li><li> Placer la phase d&#39;injection contenant de l&#39;animal et les embryons exposés sous la sonde échographique (Figure1A) pour créer imagerie en temps réel des embryons exposés à travers la paroi utérine (Figure1B). La sonde est ensuite abaissée (en utilisant les commandes motorisées) dans le bain de PBS directement sur les embryons à imager. Les images peuvent être obtenus quand la sonde est d&#39;environ 2-3 mm de l&#39;embryon. Il est très important de s&#39;assurer que la tête de la sonde ne touche pas les embryons comme il oscille d&#39;avant en arrière pour recueillir des images. </li></ol> * Le détenteur de la mère se repose dans lors de la chirurgie peuvent être facilement réalisés par un atelier d&#39;usinage. Il devrait inclure une base de plexiglas de large, avec deux côtés en plexiglas collé sur le dessus, et un espace entre eux (assez large pour la souris pour s&#39;adapter en position couchée sur le dos). Les côtés devraient avoir un terrain vallée hors d&#39;eux, qui est ensuite rempli avec de la cire noire (par exemple à partir d&#39;un bac de dissection). C&#39;est la cire sert de matériau dans lequel punaises seront pressés de maintenir enfoncée la plaque de PBS que les embryons sont baignés dans l&#39;injection. Plats 10cm ** bactérienne doit avoir un trou (environ 2cm de diamètre) découpées dans le centre de la partie inférieure (cela peut être fait avec un Heavy Duty Portable Punch et une 13/16 ème meurent centimètre circulaire: <a href="http://roperwhitney.com/punching/2-1011.cfm">http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm</a> ). En outre, les deux petits trous de chaque côté du trou de centre (environ 1,5 cm environ) doit être brûlé avec une aiguille chauffée à la flamme (ou ils pourraient être faits avec une perceuse bien sûr). Ces trous sont ensuite recouverts avec de la graisse à vide et sera le lieu où l&#39;punaises qui tiennent la plaque sur le support pousser à travers dans la cire noire. La graisse à vide est de prévenir la CPE de s&#39;échapper. Partie 4. Chargement virus dans une aiguille microinjection <ol><li> Mode d&#39;une aiguille de microinjection par biseautage une 1mm (diamètre intérieur) tiré capillaire en verre. La netteté de l&#39;aiguille est critique, et de travailler avec une aiguille suffisamment forte peut sérieusement compromettre la pénétration de la paroi utérine et le sac amniotique, et peut conduire à l&#39;échec expérimental. L&#39;aiguille aiguisée est ensuite placé dans le porte-pipette, qui est relié via un tube d&#39;une microseringue 25 uL monté dans un manuel de perfusion / retrait de la pompe (d&#39;autres dispositifs peuvent être utilisés pour réguler le chargement et le déchargement de l&#39;aiguille, mais c&#39;est ce qui est montré dans la vidéo). Pour une réactivité optimale (pour éviter l&#39;expansion et la compression associée à un système d&#39;air remplie), la microseringue, des tubes, et l&#39;aiguille doit être rempli avec de l&#39;huile minérale. </li><li> Avant de charger l&#39;aiguille s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y ait pas de bulles d&#39;air dans le système de la seringue tout le chemin à la pointe de l&#39;aiguille. Puis reculer d&#39;un petite bulle d&#39;air (1-2 mm de longueur) dans l&#39;aiguille avant de commencer à charger le virus. Cette poche d&#39;air permet de maintenir la séparation entre le virus et l&#39;huile minérale. Le stock viral à être injectée doit contenir polybrène à une concentration finale de 0,08 mg / ml (pour plus d&#39;informations sur la production de virus s&#39;il vous plaît se référer aux références 1, 2). Notez que les stocks de concentrés rétroviraux contiennent généralement une quantité importante de matières particulaires, qui contient la majorité de la matière infectieuse, et ne peuvent donc pas être filtré sans 5 - à la baisse de 10 fois en titre. En outre, selon la préparation, le stock viral peut être visqueux de l&#39;ADN génomique des cellules lysées emballage (particulièrement vrai si vous utilisez 293 cellules pour générer MLV / VSV virus pseudotypées). Si la partie aliquote de virus est visqueux, une petite quantité de DNAse I peuvent et doivent être ajoutées pour desserrer le stock, ou le chargement de l&#39;aiguille sera extrêmement difficile. Une<html> gouttelettes du stock viral (8-10 uL) doit être placé sur un morceau de parafilm stérile en préparation pour le chargement de l&#39;aiguille. Puis, en utilisant la pompe de retrait, soigneuse au chargement de l&#39;attention pour éviter de payer l&#39;aiguille sabots. Placez l&#39;aiguille chargée dans la position micromanipulateur dans la zone d&#39;injection, en faisant attention à ne pas casser l&#39;aiguille sur les embryons, ou la sonde d&#39;échographie. Notez que si pour quelque raison que l&#39;aiguille est chargé de façon significative avant l&#39;injection est de se produire, il peut être utile de dessiner une petite quantité d&#39;air dans la pointe, qui peut être déchargé avant de commencer les injections. Cette poche d&#39;air peut protéger contre le stock viral séchage à la pointe de l&#39;aiguille (un événement qui sera presque toujours rendre cette aiguille chargée inutile). </li></ol> Partie 5. Échographie injection guidée virale <ol><li> L&#39;image en temps réel créé par la sonde à ultrasons est visualisée sur le moniteur vidéo, et peut être utilisé pour guider l&#39;aiguille microinjection dans l&#39;embryon. L&#39;utilisation de ce virus de système peut être injecté dans le sac amniotique à E8.5 ou soit le sac amniotique ou le système ventriculaire du E9.5-E11.5 (Figure1B). C&#39;est la partie la plus difficile de la procédure et nécessite une quantité importante de mains sur l&#39;expérience de maître (de l&#39;ordre de 5-20 heures selon l&#39;enquêteur). La pointe de l&#39;aiguille est évident dans l&#39;image échographique comme le point le plus lumineux sur l&#39;écran, et devraient être vus se déplaçant en conformité avec les réglages de la position de la sonde (en utilisant les commandes motorisées dans le y et z avions, et la commande manuelle dans le X avion). Il est extrêmement important que la direction d&#39;oscillation de la sonde soit parallèle à la longueur de l&#39;aiguille. Ceci assurera que l&#39;aiguille reste dans le plan de l&#39;image lors des mouvements de le positionner à l&#39;injection dans l&#39;embryon. </li><li> L&#39;embryon doit être positionné de telle sorte que la région cible (dans ce cas le ventricule du cerveau antérieur) est facilement visible et accessible à l&#39;aiguille avec la moindre quantité de matériel utérin dans le chemin d&#39;injection. En outre, il est essentiel de ne pas injecter à travers le placenta. Une fois que la région du cerveau cible est aligné avec la direction de l&#39;avancement d&#39;aiguille (en utilisant le bouton sur le micromanipulateur), l&#39;aiguille doit être juste toucher la paroi utérine, puis un coup court rapidement vers l&#39;avant doit pénétrer dans le tissu. Une approche similaire est utilisé pour pénétrer le sac amniotique et le cerveau. Dans certains cas, l&#39;enquêteur et expérimentés peuvent frapper le ventricule en un seul mouvement, surtout si l&#39;aiguille est très forte. La mécanique du déplacement de la sonde, l&#39;aiguille, et les embryons (en déplaçant la mère sur la scène), nécessitent des exercices pratiques à maîtriser. </li><li> Une fois que le nombre souhaité d&#39;embryons a été injecté, à proximité de la paroi abdominale avec 5,0 points de suture en soie. La mécanique de suture ne sont pas spécifiques à ce type de chirurgie. Enfin, l&#39;utilisation autoclips vétérinaires à base de la peau ainsi que sur les points de suture dans le muscle abdominal. Suture de la peau n&#39;est pas recommandée parce que la souris se mâchent sur les points de suture. L&#39;analgésie doit être appliquée à la zone d&#39;incision pour réduire la quantité de douleur ressentie par la souris comme il se réveille. Il est recommandé une solution de bupivacaïne 0,25% être injecté (0,8 ml / kg ou 2 mg / kg) par voie sous cutanée toutes les quelques millimètres le long du site d&#39;incision. </li><li> Alors que la souris récupère doucement l&#39;animal sur un papier absorbant dans une cage propre contenant un sachet de gel (pour faciliter l&#39;alimentation et l&#39;hydratation). Placez la cage sur un ensemble plus chaud, à 37 ° C pour maintenir la température du corps. Lorsque réveillé, placez la souris et le sachet de gel dans une cage propre et revenir à la grille d&#39;origine animale. </li><li> Le jour suivant, vérifiez la souris pour tout saignement vaginal, de contractions abdominales et / ou une apparence générale en détresse, qui indiquent l&#39;avortement. Si c&#39;est le cas, la souris euthanasier immédiatement. Les cheveux bien coiffés et un aspect sain global indiquent récupération réussie de la chirurgie. Les embryons injectés peuvent être sacrifiés embryonnaire ou après la naissance pour une analyse ultérieure. Si le virus exprime un gène rapporteur, comme la phosphatase alcaline humaine (PLAP) ou GFP, une coloration va révéler les zones d&#39;infection virale positive (Figure1C). </li></ol> Les résultats représentatifs Embryons injectés peuvent être sacrifiés 1-2 jours après l&#39;injection tout le chemin jusqu&#39;à l&#39;âge adulte. Si le virus exprime un gène rapporteur, comme PLAP ou GFP, alors l&#39;expression journaliste sert à identifier les cellules infectées par des virus et des clones de ces cellules. Par exemple, la figure 1C est une section de tissu d&#39;un cerveau post-natal qui a été infecté in utero à E9.5 avec un vecteur rétroviral exprimant PLAP. Les cellules infectées sont visualisés comme des grappes pourpres après coloration histochimique. En plus d&#39;identifier les cellules infectées par des virus, l&#39;expression de journaliste permet d&#39;examiner la morphologie cellulaire et de la position, ainsi que le statut d&#39;expression génique. nt &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2047/2047fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Injection virale dans les ventricules du cerveau antérieur E9.5 souris. A. L&#39;animal anesthésié est placé sur la phase d&#39;injection. Deux embryons seraient exposés et placé sous la sonde d&#39;échographie à l&#39;endroit indiqué (flèche). L&#39;aiguille de microinjection rempli de virus est situé près de l&#39;embryon et alignés avec la sonde d&#39;échographie. Ecran B. capture d&#39;une image échographique en temps réel à partir d&#39;un embryon de souris E9.5. V, le ventricule, comme, sac amniotique; UW, la paroi utérine. Les embryons ont été injectés C. avec un virus exprimant au PLAP E10.5. Coloration histochimique de PLAP révèle l&#39;emplacement des événements d&#39;infection virale.

<ol>
	<li>Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+high-titer+pseudotyped+retroviral+vectors+with+very+broad+host+range.">Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range.</a> Methods Cell Biol. 43, 99-112 (1994).</li><li>Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li></ol>

Injections virale utilisant guidage échographique peut être réalisée à partir E8.5-E11.5, où seul le sac amniotique peut être injecté à E8.5, tandis que les deux le sac amniotique et le système ventriculaire peut être injecté à partir de E9.5-E11.5. Quand elle est réalisée correctement, les particules virales injectées dans le système ventriculaire à l&#39;aide guidage échographique ont accès à des cellules tapissant le système ventriculaire et, par conséquent, peuvent infecter les différentes structures du cerveau antérieur (néocortex, noyaux gris centraux, diencéphale, yeux, etc), le mésencéphale et rhombencéphale (Figure1C). Virus injecté dans le sac amniotique a accès à des cellules à l&#39;extérieur de l&#39;embryon. En plus de virus, guidage échographique peut également être utilisé pour injecter des cellules dans l&#39;embryon en développement. Par conséquent, cette technique fournit de multiples options à choisir (période de développement, la structure, les virus / cellules) lors de la conception d&#39;une expérience. Il est essentiel que le virus injecté ou cellules expriment un journaliste pour une identification facile des cellules infectées / injecté. Historiquement, phosphatase alcaline placentaire humaine (PLAP) ou GFP ont été utilisés. Par expérience, nous avons trouvé PLAP peut être un gène rapporteur très utile parce que les deux PLAP histochimique et la coloration immunohistochimique des rendements d&#39;une cellule forte et distincte seule tache qui permet d&#39;analyser la morphologie des cellules et la position, et de procéder à une analyse clonale. Depuis expression de la GFP virale peut être faible, un rapporteur GFP peut-être pas idéal pour la coloration des tissus, mais est utile si l&#39;on veut obtenir des cellules isolées par tri cellulaire par fluorescence (FACS).

«L&#39;un des microscopes suivantes rétrodiffusion échographie peut être utilisée pour cette procédure. Bien que dans la vidéo du P40 d&#39;un changement de paradigme médical est utilisé, le P40 n&#39;est plus disponible dans le commerce, et a été remplacé par le P60, qui est même prix et peut être utilisé pour la même application. Le matériel supplémentaire décrite pour la construction de scènes sont à utiliser avec un changement de paradigme médical appareil (s). Le Vevo 2100 est livré avec l&#39;équipement pour l&#39;imagerie du petit animal. <ol><li> P60 biomicroscope ultrasons (UBM) de Paradigm médicale ( <a href="http://www.paradigm-medical.com/ubms.html">http://www.paradigm-medical.com/ubms.html</a> ). </li><li> Vevo 2100 de VisualSonics ( <a href="http://www.visualsonics.com/">http://www.visualsonics.com/</a> ) </li></ol> Anesthésiques et analgésiques La solution du Nembutal (50 mg / ml de pentobarbital sodique injectable; produit par Abbott Laboratories) peuvent être obtenus auprès de Santé animale Bulter Schein. Notez que ceci est une substance contrôlée de l&#39;annexe II et nécessite une Drug Enforcement Agency (DEA) de licence à obtenir. La solution de bupivacaïne (0,25%; produit par Hospira, Inc, entre autres) peuvent être obtenus à partir d&#39;un certain nombre de distributeurs, dont Moore médicale.

ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at e9.5

En chirurgie de survie in utero chez la souris permet la manipulation moléculaire de l&#39;expression des gènes pendant le développement. Cependant, parce que la paroi utérine est opaque durant l&#39;embryogenèse précoce, la capacité de cibler des parties spécifiques de l&#39;embryon pour la microinjection est fortement limitée. Heureusement, l&#39;imagerie par ultrasons à haute fréquence permet la génération d&#39;images qui peuvent être utilisés en temps réel pour guider une aiguille microinjection dans la région embryonnaire de l&#39;intérêt. Nous décrivons ici l&#39;utilisation de l&#39;imagerie telles pour guider l&#39;injection de vecteurs rétroviraux dans le système ventriculaire du cerveau antérieur de souris au jour embryonnaire (E) 9.5. Cette méthode utilise une laparotomie pour permettre l&#39;accès aux cornes utérines, et une plaque spécialement conçue qui permet embryons hôtes d&#39;être baigné dans une solution saline pendant qu&#39;ils sont imagés et injectée. Chirurgies réussies entraînent souvent dans la plupart ou la totalité des embryons injectés survivre à n&#39;importe quel point du temps ultérieur d&#39;intérêts (embryonnaire ou postnatale). Les principes décrits ici peuvent être utilisés avec de légères modifications à effectuer des injections dans le liquide amniotique d&#39;embryons E8.5 (permettant ainsi l&#39;infection ainsi que l&#39;étendue antéro-postérieure du tube neural, qui n&#39;a pas encore fermé), ou dans le système ventriculaire du cerveau à E10.5/11.5. En outre, à la mi-neurogène âges (~ E13.5), l&#39;échographie peut être utilisée injection directe dans les régions cérébrales spécifiques de l&#39;infection virale ou une transplantation de cellules. L&#39;utilisation de l&#39;échographie pour guider les injections in utero chez la souris est une technique très puissante qui permet la manipulation moléculaire et cellulaire des embryons de souris de manière qui serait autrement extrêmement difficile, voire impossible.

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Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

En chirurgie de survie in utero chez la souris permet la manipulation moléculaire de l&#39;expression des gènes pendant le développement. Nous décrivons ici l&#39;utilisation de l&#39;imagerie à haute fréquence à ultrasons pour guider l&#39;injection de vecteurs rétroviraux dans le cerveau de souris au jour embryonnaire (E) 9.5.

Guidée par échographie microinjection dans le cerveau antérieur souris In Utero À E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

ultrasound-guided-microinjection-into-mouse-forebrain-utero-at

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

17.8K vues.  Johns Hopkins University School of Medicine. En chirurgie de survie in utero chez la souris permet la manipulation moléculaire de l'expression des gènes pendant le développement. Nous décrivons ici l'utilisation de l'imagerie à haute fréquence à ultrasons pour guider l'injection de vecteurs rétroviraux dans le cerveau de souris au jour embryonnaire (E) 9.5.

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Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Imagerie time-lapse en direct de relation clonale cellules progénitrices neurales dans le cerveau antérieur développement Zebrafish

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

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Neurosciences

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Livraison efficace de gènes dans les Territoires du SNC multiples à l&#39;aide In Utero L&#39;électroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Souris dans Utero électroporation: contrôlé Transefection Gene spatio-temporelle

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes en tranches aiguës du cerveau antérieur souris adultes

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisation et la manipulation génétique des dendrites et des épines dans le cortex cérébral et l&#39;hippocampe de souris à l&#39;aide<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance imaging. However, use of such methods in animal models requires anesthesia and hence both alters the brain state and prevents behavioral measures. An alternative method is the use of in vivo microdialysis to take continuous measurement of brain extracellular fluid concentrations of glucose, lactate, and related metabolites in awake, unrestrained animals. This technique is especially useful when combined with tasks designed to rely on specific brain regions and/or acute pharmacological manipulation; for example, hippocampal measurements during a spatial working memory task (spontaneous alternation) show a dip in extracellular glucose and rise in lactate that are suggestive of enhanced glycolysis1-3,4-5, and intrahippocampal insulin administration both improves memory and increases hippocampal glycolysis6. Substances such as insulin can be delivered to the hippocampus via the same microdialysis probe used to measure metabolites. The use of spontaneous alternation as a measure of hippocampal function is designed to avoid any confound from stressful motivators (e.g. footshock), restraint, or rewards (e.g. food), all of which can alter both task performance and metabolism; this task also provides a measure of motor activity that permits control for nonspecific effects of treatment. Combined, these methods permit direct measurement of the neurochemical and metabolic variables regulating behavior.

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Modulation of hippocampally-dependent spatial working memory by direct intrahippocampal microinjection, accompanied and followed by in vivo microdialysis for metabolites in conscious, behaving animals.

La micro-injection d&#39;insuline de l&#39;hippocampe et<em&gt; In vivo</emMicrodialyse&gt; Test de la mémoire spatiale cours

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

Prosencéphale enregistrement électrophysiologique des larves dans le poisson-zèbre

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

Manipulation génétique de la souris en développement à travers l&#39;hypothalamus<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Infusion stéréotaxique des oligomères bêta-amyloïde dans les Hippocampus souris

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, latéral Septal Nucleus- et le striatum spécifique<em&gt; In Utero</em&gt; L&#39;électroporation dans la souris C57BL / 6

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...