Bu çalışma, MRC M. FS bir hibe ile desteklenmektedir.

1. Embriyoların geliştirilmesi <ol><li> Serilir zaman, yumurta koryon eklenti filamentler, çünkü kümelenmiş. Embriyoların normal geliştirmek izin vermek için, ayrı yumurta gereklidir. Karışmayan ve iki forseps ile ek filamentler tutarak eklenti filamentler kesmek. </li><li> Unclustering sonra dışkı ve yosun, yumurta ayrılır ve maksimum yoğunluk 6cm Petri kabı başına 40 yumurta, taze embriyo orta transfer. </li><li> Medaka embriyoların 27 zebrafish biraz daha yavaş gelişir ° C. Iki tür arasında kuluçka zamanlaması farklıdır; Medaka embriyolar, 7 gün içinde koryon yumurtadan çıkar ve hemen zebrafish embriyoların 2 gün içinde yumurtadan ise yüzmek ve yemeye başlar ancak 5-6 gün denize girmek ve yemeye başlar. Medaka Geliştirme Iwamatsu hazırlama 4 göre sahnelenir. </li><li> Medaka embriyo gelişimi deneysel planlarına uygun sıcaklık seçerek rahatlıkla ayarlanabilir. Medaka embriyoların Kalkınma erken gelişim 4 ° C&#39;de durdurulabilir. Aşamada 24 saat sonra kalp atmaya başladığında, geliştirme minimum sıcaklık 18 ° C ile yavaşlatılabilir. </li><li> Zebrafish somitegenesis beyin gelişimi öncesinde ise organ / dokuların görünümü zamanlama zebrafish ile karşılaştırıldığında Medaka biraz daha farklı, Medaka somitogenesis yani beyin gelişimi başlamasından sonra ortaya çıkar. </li></ol> 2. Koryon çıkarma Medaka koryon sert bir iç tabaka ve yumuşak bir dış yüzeyi ile iki koruyucu tabaka oluşur. Böylece, bir iki adım proteaz tedavi pronase ve kuluçka enzim istihdam koryon kaldırmak için gereklidir. Bir kez dechorionated, embriyoların 1X BSS tutulmalıdır. Yarı steril koşullarda uzun süreli gözlem gereklidir, özellikle dechorionated embriyoların başarılı kültür artıracaktır. Bunlar% 70 etanol ile 1X BSS ile durulama ardından steril steril solüsyonların kullanımı (örneğin antibiyotik ile 1X BSS sterilize) ve araçları kullanarak içerir. Dechorionated Medaka embriyolar dechorionated zebrafish embriyolar daha yumuşak ve daha kırılgan olduğu için, ekstra bakım sağlamak için pipet hava kabarcıkları temasa geçmeyiniz, bu ani çöküşü neden olarak alınmalıdır. Embriyoların en az zararla sağlamak için, geniş ağızlı ısı pipet pompa ile parlatılmış cam pipet embriyolar transfer için kullanılan olmalıdır ve bir saç döngüsü, gözlem için embriyolar yolunuzu kullanılmalıdır. Sigara yapışık Petri kutularına embriyolar yüzeylere tutunmasını önlemek için kullanılmalıdır. <ol><li> Dechorionation için önce yumurta yeterince ayrılmış ve temizlenmiş olduğu kontrol edilmelidir. </li><li> Pronase ve kuluçka enzimler proteinazı olduğundan, buz üzerinde tutulmalıdır ve bu enzimlerin embriyoların maruziyeti en aza indirmek olmalıdır. </li><li> Zımpara (P2000 tane iriliğine, su geçirmez) 9cm petri kabı kapağı yerleştirilir yumurta transferi. Aşırı orta çıkarın ancak embriyo kurumasını önlemek için yeterli bir hacim kalmasını sağlamak. </li><li> Dış yüzeyi kılların bazılarını kaldırın ve hafifçe koryon yüzeyinde (Şekil 1) puan 45-60 saniye için embriyolar yavaşça döndürün. Orijinal Petri kabı geri embriyo transferine ve incelemek. Zımpara üzerinde yuvarlanma embriyolar minimum basınç uygulayarak ve zımpara kağıdı yüzeyinde parmak paralel tutulması, işaret parmağı kullandığınızda. Bir defada 5-7 embriyolar daha fazla rulo etmeyin. Bu önlem, embriyoları birbirlerine altında ezilme riski en aza indirecektir. </li><li> 27 20mg/ml pronase ve 40-60 dakika inkübe embriyolar ile bulaşık yumurta orta değiştirin ° C. Emin olun embriyolar yeterince pronase kapsadığı ve yemeğin üzerine bir kapak bulunur. Kullanılmayan pronase öz-sindirimi en aza indirmek için bu adımı sırasında buz üzerinde tutulmalıdır ve aktivite (yaklaşık 1-2 hafta) kaybolana kadar tekrar edilebilir. </li><li> Pronase, yeniden kullanım ve 5X yıkama embriyolar eklenecek kuluçka enzim inaktive olarak pronase izlerini kaldırmak için embriyonun orta kurtarma. </li><li> Embriyolar tek tabakalı bir çanak olarak oturup sağlamak, kuluçka enzim ile embriyo orta ve kapak embriyolar çıkarın. Yumurta çanak biri diğerinin üstüne oturup koryon erirken, altta kalanlar ezilmiş olacak. Buz üzerinde kullanılmayan kuluçka enzim tutun. </li><li> 27 embriyolar ° C&#39;de ve 15 dakika sonra bir stereomikroskopta kullanarak kuluçka ilerleme periyodik olarak kontrol edin. Bu ay krater gibi delik bir dizi koryon iç tabakası, kısa sürede kolayca manuall kaldırıldı koryon yumuşak dış tabaka bırakarak aşağıdaki çözünür belirmeye başlar görülecektiry Tüm kuluçka süreci 15-60 dakika sürebilir. </li><li> 1X BSS içeren Petri embriyolar koryon çıkıp, embriyo transferi. Pipet ucu embriyoların yavaşça rulo izin BSS yüzeye dokunarak 1X BSS kuluçka enzim aktarmak için değil emin olun. </li><li> Tüm embriyolar transfer kuluçka enzim sonra, 1X BSS başka bir taze çanak son bir transfer yapmak. Bu maruz kalan embriyoların zarar verecek embriyolar, kuluçka enzim herhangi bir kalıntıları maruz kalmaz sağlar. Bir kere bu son yemek koryon dış tabakası hala sahip herhangi bir embriyolar stereomicroscope altında sterilize mikro-forseps kullanarak elle kurtarılmış olabilir. Embriyolar aşağıdaki dechorionation geliştirilen gerekiyorsa, penisilin / streptomisin bakteri gelişimini engellemek amacıyla BSS ilave edilmelidir. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 dechorionation sırasında haddelenmiş ve kusursuz embriyolar Karşılaştırılması. Paneli B haddelenmiş embriyolar paneli A. kusursuz embriyolar görülen kıllar nasıl eksikliği dikkat edin 3. Montaj dechorionated embriyolar Agaroz gömme, canlı embriyo görüntüleme daha uzun süre (örneğin time-lapse görüntüleme) yanı sıra sabit embriyoların ayrıntılı gözlemler için yararlıdır. Gastrulasyon ve erken organogenez (sahne sahne 28 14) sırasında, Medaka embriyoların periderm, gelişmekte olan embriyo ve yumurta sarısı 5 de kapsayan bir doku tabakası boyunca ritmik kasılma hareketleri dalgaları sergilerler. Embriyolar kasılma hareketleri durdurmak için 6 3.5mm 1-heptanol ile tedavi edilir. Aşamada 28 (64hpf) sonra embriyolar hareketi durdurmak için, embriyolar gömmeden önce Tricaine mesilate (TMS) ekleyerek damla anestezi. TMS (sadece az miktarda ekleyin, bu doz, yaklaşık 01:25 seyreltme optimize edilmesi gerekiyor) agaroz eklenir. <ol><li> 37 ° C ve bu sıcaklıkta muhafaza ısıtma ile% 3 jelleşme sıcaklığı düşük agaroz (1X BSS) küçük bir miktar çözülme. </li><li> Aşağıdaki adımları agaroz embriyo yönlendirici önce katılaşmaya olmadığından emin olmak için hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Eppendorf tüp kap depresyon doldurmak için geniş ağızlı bir cam pipet aktarımı yeterli erimiş agaroz kullanma. </li><li> BSS embriyo üzerinde taşıma kap depresyon en aza indirmek için bir dechorionated embriyo transferi. Hemen alımı kap depresyon ve bir Petri kabındaki kültür odasına transfer agaroz ve embriyo. Altındaki bir cam pencere ile 3.5cm Petri kabı kullanılır. Ters bir mikroskop kullanarak görüntüleme için, embriyolar yönelik gövde ön yüzü aşağı bakacak şekilde ve kapak cam yakın yerleştirilir. Dik bir mikroskop kullanarak görüntüleme için, agaroz kalınlığı en aza indirilmiştir. </li><li> 3.5cm Petri kabı, buz ve su (suyun büyük bir çanak kabaca 1 / 3 toplam derinlik doldurulur) içeren bir 14cm çaplı Petri kabı içine aktarın. Odanın alt 14cm Petri kabı sıkıca aşağı tutarken, hafifçe erimiş agaroz istediğiniz gibi embriyo yolunuzu bir saç döngüsü kullanımı ve embriyo agaroz orijinal konumuna yavaşça yükselterek daha küçük çanak ve indirme katılaşır kadar basılı tutun. buz gibi soğuk su. </li></ol> 4. Medaka embriyolar hücre nakli Bu prosedürün amacı, ilgi gen hücre özerk (hücre içinde) veya olmayan hücre-otonom (hücreler arası) eylemleri belirlemek için. Donör hücreleri nakli değerlendirme sağlayan, nakli için önce rodamin-dekstran gibi bir izleme boya (eşlik eden Jüpiter protokol &#39;Medaka Embriyolar Of Mikroenjeksiyon&#39; belirtildiği gibi) veya kullanılan olabilir GFP ekspresyonu ile transgenik gerginlik etiketli olabilir. Hem etiketleme teknikleri bir arada sık sık karşılaşılan otomatik floresan üstesinden gelmek için yararlıdır. Transplantasyonundan sonra zaman atlamalı çalışmalar için, GFP ifade yararlıdır. Bu işlem boyunca pipet pompa ile geniş ağızlı cam pipet kullanın ve% 70 ile tüm araçları (slaytlar dahil) önceden sterilize EtOH steril 1X BSS ile durulama kapsamlı izledi. Bu nakli yürüten ventral ve dorsal direkleri ayrımcılığa izin Alıcı embriyolar genellikle etrafında aşamada 12 geliştirilmiştir. <ol><li> Enzim inkubasyon sırasında nakli ve kurulum enjeksiyon aparat önce embriyolar 1.5 saat dechorionating başlar. </li><li> Boşluğuna mikroskop lamı 9cm çaplı Petri kabı içine yerleştirin. </li&gt; <li> % 3 metilselüloz küçük bir miktar boşluğuna steril bir pipet kullanarak slayt merkezi ekleyin ve ince yayılabilir. </li><li> Kuru metilselüloz yaklaşık 1-2 dakika. </li><li> Slayt depresyon doldurmak için steril 1X BSS 350μl ekleyin. </li><li> Cam bir pipet kullanarak slayt için bir donör embriyo ve dört adede kadar alıcı embriyoların transferi. </li><li> Embriyonun blastodermin yukarı bakacak şekilde bir saç döngü kullanarak yolunuzu embriyolar. Embriyolar daha da artması istikrar birbirlerine karşı leant olabilir. </li><li> Donör blastodermin ve yavaş yavaş alımı 10-20 hücreler yavaşça içine mikro iğne takın. </li><li> Alıcı embriyo blastodermin gerekli bölgeye hafifçe iğne yerleştirin ve hücrelerin yavaş yavaş dışarı atmak. Alıcı blastodermin hücreler ekleyerek bu embriyonun ölümüne neden olacağı gibi, hücre-yolk kesesi sınır bozmak için değil, büyük bir titizlikle alınmalıdır. </li><li> Sterilize 1X BSS Petri kabı içine dökün. Dikkatle BSS embriyolar bozabilir yemeğin yanında değil mümkün olduğunca yakın olarak çanak içine dökün. Embriyoların üzerine doğrudan BSS dökün ve slayt ve embriyolar dalmış olduğu gibi yeterli BSS ilave edilmemelidir. </li><li> Penisilin / streptomisin çanak ve kapak 100μl ekleyin. Normal gelişimi sağlamak için dikkatli bir şekilde 27 ° C inkübatör çanak aktarmak. </li><li> Embriyolar periyodik olarak istediğiniz gibi görülebilir. Kazanç-fonksiyonu ve / veya fenotip kurtarma deneyleri yürütmek için nakli kullanırken, görülen bazı morfolojik değişiklikler nakli etkileri nedeniyle olabilir. Böylece birden fazla transplantasyon gereklidir. 2-3 gün sonra, melanophores yolk kesesi, baş, göz ve gövde mevcut olmalıdır. Nakledilen embriyoların bulunması daha sonra başarılı bir chimera büyük olasılıkla üretilen varsa (Şekil 3). </li></ol> Eğer 55 ° C 4 saat 10 dakika 94 ° C ve PCR yürütmek. 20mg/ml proteinaz K. inkübe 25μl içeren PCR tüp (ler) transfer gerekli, genotip donör embriyo (lar) 5. Temsilcisi sonuçları <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2: Örnek bir agaroz gömülü embriyonun konumu . Anterior Sağda gösterilen ve görünümü dorsal. Panel B: endotel hücreleri embriyo vücudun her iki tarafında görülebilir ve fli organizatörü tarafından tahrik GFP ile etiketlenir. <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 transplantasyon sonrası embriyoların Görüntüler. Image hemen transplantasyon sonrası bir donör ve alıcı embriyo gösterir. Donör embriyo tamamen kırmızı blastodermin (ok) sağ tarafta gösterilmiştir. Alıcı embriyo soldaki gösterilir ve blastodermin (ok ucu) görünür kırmızı nakledilen hücrelerin küçük bir kitle tarafından kolayca tanımlanır. Resim B iki alıcı embriyolar sonrası transplantasyonu (27 ° C&#39;de inkübe) yaklaşık 7 saat. Nakledilen hücrelerin nakli sitesinden göç etmiş ve şimdi blastodermin (oklar) dağılmış dikkat edin. Resim C st.29 (yaklaşık 74hpf) bir alıcı embriyo gösterir. Pigmentasyon, gövde ve beyin bölgesi (oklar) göz ve melanophores varlığını unutmayın. Rodamin etiketli hücrelerin embriyonik yapıların bir kabus başarılı bir üretim olduğunu gösteren birçok kolonize görülebilir.

<ol>
	<li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka,+Oryzias+latipes.">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li><li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka+and+zebrafish,+an+evolutionary+twin+study.">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech Dev. 121, 629-6237 (2004).</li><li>Hirose, Y., Varga, Z. M., Kondoh, H., Furutani-Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+lineage+and+regionalization+of+cell+populations+during+Medaka+neurulation.">Single cell lineage and regionalization of cell populations during Medaka neurulation.</a> Development. 131, 2553-2563 (2004).</li><li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes.">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Zool Sci. 11, 825-839 (1994).</li><li>Cope, J., Fluck, R., Nicklas, L., Plumhoff, L. A., Sincock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stellate+layer+and+rhythmic+contractions+of+the+Oryzias+latipes+embryo.">The stellate layer and rhythmic contractions of the Oryzias latipes embryo.</a> J Exp Zool. 254, 270-275 (1990).</li><li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Whole+Mount+High-Resolution+Double+Fluorescent+In+Situ+Hybridization.">Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

Bu video dechorionate ve Medaka embriyolar hücre transplanataion yürütmek nasıl göstermektedir. Bu gelişim sırasında gen / protein fonksiyonunun yanı sıra çalışma, söz konusu gen / protein özerklik nedenlerine açıklık için kimerik embriyolar üretmek için güçlü bir tekniktir. Medaka vivo gerçek-zamanlı görüntüleme de iyi kurulmuş kaderi haritalar ve şeffaflık kredi nedeniyle bu teknik için yararlı bir omurgalı model sistem. Nakli nakledilen hücrelerin davranışını kolayca görülebilir, böylece mikroenjeksiyon (eşlik eden Jüpiter protokol &#39;Medaka Embriyolar Of Mikroenjeksiyon belirtildiği gibi) ile kombine edilebilir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Embryo medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Made in-house</td>
<td>N/A</td>
<td>200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.)</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro-dissecting forceps</td>
<td>Tools</td>
<td>55 INOX A.DUMONT&amp;FILS</td>
<td>N/A</td>
<td>Very sharp fine tips for removal of chorion.</td>
</tr>
<tr>
<td>Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size</td>
<td>Tools</td>
<td>Hermes Abrasives Ltd.</td>
<td>N/A</td>
<td>Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.</td>
</tr>
<tr>
<td>3% methylcellulose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M 0512</td>
<td>High viscosity for holding embryos in place during transplantation.</td>
</tr>
<tr>
<td>1X BSS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Made in-house</td>
<td>N/A</td>
<td>20XBSS: 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO4.7H2O, 4g CaCl2.2H2O, and 10mg Phenol Red in 1L MilliQ water and autoclave; 500mM Hepes in MilliQ water autoclaved. Add 25ml 20XBSS and 15ml 500ml Hepes pH7.0, fill up to 500ml and filter sterilize before use.</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>Added to BSS when incubating dechorionated embryos.</td>
</tr>
<tr>
<td>Pronase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>53702</td>
<td>For dechorionation.</td>
</tr>
<tr>
<td>Hatching enzyme</td>
<td>Reagent</td>
<td>Made in-house</td>
<td>N/A</td>
<td>For dechorionation.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tricaine mesilate (TMS)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-5040</td>
<td>400mg tricaine in 97.9ml distilled water and 2.1ml 1M Tris, pH adjusted to 7; 4.2ml of this solution in 100ml clean tank water.</td>
</tr>
<tr>
<td>3% ultra-low gelling temp. agarose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-2576</td>
<td>Type IX-A. Used during embedding of embryos for observation.</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dish culture chamber</td>
<td>Tool</td>
<td>Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.</td>
<td>11-004-008</td>
<td>Iwaki glass base dish 35mm with 12mm window. Used during embedding of embryos for observation.</td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Narishige</td>
<td>N/A</td>
<td>Model MN151. For removal and insertion of cells during transplantation.</td>
</tr>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>GC100-10T</td>
<td>For making transplantation needles.</td>
</tr>
<tr>
<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>Model P-97 </td>
<td>For making transplantation needles.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

dechorionation of medaka embryos and cell transplantation for the generation of chimeras

Medaka, hem de genetik ve embriyolojik analizler sağlar ve genom fenotip odaklı mutant ekranlarında 1 yürütülen edildiği üç omurgalı model organizmaların biridir yumurta küçük bir tatlı su balığı . Medaka ve zebrafish arasında ilgili genlerin fonksiyonel örtüşme Farklılıklar, böylece tek bir türün 2, Medaka ve zebrafish omurgalı genomu fonksiyonları genetik diseksiyon için tamamlayıcı tanımlanamayan roman fenotiplerinin kimlik sağlar . Manipülasyon gibi dechorionation Medaka embriyolar, görüntüleme ve hücre nakli için montaj embriyolar, bir laboratuvarda, Medaka ve zebrafish hem de üzerinde çalışmak için temel prosedürler vardır. Hücre nakli Medaka mutasyonlar hücre özerklik inceler. Chimeras etiketsiz alıcı embriyolara nakli donör embriyolardan etiketli hücreler tarafından üretilir. Donör hücreleri nakledilen hücrelerin klonları geliştirme sırasında ilgi doku entegre edilebilir ve böylece kaderini haritaları 3 dayanan alıcı embriyolar belirli alanlarda transplante edilebilir. , Sert koryon ve yumuşak embriyolar, Medaka embriyo manipülasyonu nedeniyle daha zebrafish içinde daha fazla yer almaktadır. Bu video, Medaka embriyolar işlemek için ayrıntılı yordamlar göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras at JoVE.com

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

, Sert koryon ve yumuşak embriyolar, Medaka embriyo manipülasyonu nedeniyle daha zebrafish içinde daha fazla yer almaktadır. Bu video görüntüleme ve kuruntulardan üretimi için hücre nakli için agaroz dechorionation montaj Medaka embriyolar işlemek için nasıl adım adım yordamlar, gösterir. Bu prosedürler, omurgalı genomu fonksiyonları genetik diseksiyon için tamamlayıcı özellikleri tam olarak yararlanmak için bir laboratuvar Medaka ve zebrafish kullanmak için gereklidir.

Chimeras Üretim Medaka Embriyolar ve Hücre Nakli Dechorionation

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

dechorionation-medaka-embryos-cell-transplantation-for-generation

Research

JoVE Journal

Biology

17.6K Görüntüleme.  University of Bath. , Sert koryon ve yumuşak embriyolar, Medaka embriyo manipülasyonu nedeniyle daha zebrafish içinde daha fazla yer almaktadır. Bu video görüntüleme ve kuruntulardan üretimi için hücre nakli için agaroz dechorionation montaj Medaka embriyolar işlemek için nasıl adım adım yordamlar, gösterir. Bu prosedürler, omurgalı genomu fonksiyonları genetik diseksiyon için tamamlayıcı özellikleri tam olarak yararlanmak için bir laboratuvar Medaka ve zebrafish kul...

Video: Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

I am Christina Ceso. I am a postdoc in David's Den lab and I work on the hematopoietic stem cells. Today we are going to purify long-term recuperating hematopoietic stem cells and we'll transplant them into a mouse.We start by spraying the mice with alcohol so that first of all, the mind starts sterilized and also the hair doesn't interfere with the dissection. We use PBS with 2%serum for the dissection. I cut the back skin and I pull the skin apart in order to expose the tissue.In order to isolate the tibia, I hold the tibia with tweezers. I cut the tendon on top of the knee and I cut the muscles below the knee and after that I cut through the knee so that the TBI is not connected to the rest of the limb anymore and I pull in order to isolate it. I then hold the TB upside down and with the scissors I separate the foot from the tibia In order to obtain the femur.I cut the muscles around the femur and then I dislocate the femur from the hip. In order to isolate the hip, I cut the muscle around the hip bone on the side of the tail of the mouse and then I pull the hip away from the body of the mouth In order to isolate the spine. I cut through the tail as close as I can to the beginning of the back and then I cut on the two sides of the spine and below the spine, trying to stay as close as possible to the spine so that the peritoneum is not cut and the intestine is left untouched.A first round of cleaning of the bones is done with a scalpel, which is used to scrape the bone, the muscles away from the bone. The scalpel is good to clean the femurs, the hip and the spine. In order to clean the tibia, I hold them with forceps and I use the forceps to remove as much tissue as possible.A second round of cleaning is done using clean wipe to completely clean the bones outta the muscle, and I use the F wipe to clean the tibia, the femurs and the hips. So this is how bones look. After cleaning, I prefer 50 amount tubes with filters on top and I transfer the bones into the mortar.I add the section media and I crush the bones ask of the first round of crashing of the bones. I piped the mixture in order to release as many styles as possible into solution and reduce clumps. I transferred the mixture on the tubes through the filters and this is what the bone fragments look like after the first round of crushing.So I add more dissection medium to the bone fragments and I flash them again. I transferred the seline mixture to the tubes through the filters and at this point the remaining bone fragments are white and there is no bone marrow left. The tubes are filled with PBS 2%serum and in order to have them all with the same weight so that they're balanced in the centrifuge, but also in order to wash the filters so that we obtain as many cells as possible, I then centrifuge the cell mixture and after centrifugation, the palt includes the bone marrow cells.I aspirate the medium and I move back and forward the tube on the rack so that the pelle is becomes loose and fewer clamps are formed. When I add medium, at this point I add one ml of medium per tube and I ics since I'm sorting hematopoietic stem cells. Later on, I'm going to store an ALI output of total bone marrow sizes at this point, which I will use later for the fact single color control.I add lineage antibody cocktail. I ordered the samples to mix them well and I invaded four degrees for 15 minutes. In the meantime, I start preparing the columns for the lineage division.I put the columns on the magnet and I prepare Ian tubes under the columns. I also prepared the gas PBS using aster flip filter and attaching it to the vacuum so that all the bubbles of air move in the top part of the filter. I then add three ml of the gas DBS to each column in order for the column to become wet.After the incubation with the antibodies, I add medium to the cell samples and I centrifuge them in order to remove the excess of antibodies. After the centrifugation, the stain cells are in the pallet. I aspirate the medium and I suspend the pallet in one mile of the gas PBSI Add the strip tab beans, I mix the cells and I incubate for 15 minutes at four degrees.After the incubation, I put new elucian tubes under the columns. I add two ml of PBS to each tube with the cells and I transferred the cell mixture to the column through a 40 micron filter. I wash the tubes with more medium in order to collect all the cells remaining and I apply the remaining medium through the filters to the columns.The progenitor cells lineage low are alluded into the collection views. I pulled the luted samples and I sent tofu them. So after the centrifugation, the depleted cells are in a white pate.I aspirate the medium and re suspend the cells. I store an adequate of the depleted cells and I add the antibodies to the cell mixture for the sorting and also to all the single color controls. The antibodies are incubated in that with the size for 15 minutes in the fridge.After the ation, I add medium to the cells and and centrifuge them to remove the ex excess of antibodies. After the centrifugation, the cells are in the pt, I aspirate the media that I suspend the cells and I transfer the cells into fox tubes with a blue filter. At this point, the cells are ready to be sorted.I place, I place the mouse under a heating lamp for a few minutes so that the veins dilate and they are more easily seen. When preparing the syringe, you have to be careful to eliminate all the bubbles from the, the mixture that is in the syringe and then you bend the needle at 90 degrees. I put the mouse under a glass cup with a weight on top so that it can run away.I sterilize the tail with the alcohol pad so that the site of injection is sterile, but also it's easier to identify the vein. If you look at the tail of the mouse from the top in the middle and top of the tail, there is an artery while on the two sides there are the two veins and we inject the cells in one of the two veins. I insert the needle into the vein and I inject following injection.It is to wait for a couple of seconds before removing the needle, the needle, and after that I clean the side of injection. This is a representation of the syringe with the ben needle bent at 90 degrees with the knee, the at this ankle compared to the tail, which makes the injection the easiest. When you injecting the tail of the mouse, you have to keep in mind that the tail vein is extremely superficial, so really this is the orientation of the needle compared to the tail.And it looks like you will just keep sliding on top of the tail, but actually you will get into the tail then. I am Christina Ceso. I am a post in David Kaden lab, and I work on the hematopoietic stem cells.I usually use for animals to start with, and I had more variability at the beginning, but once you become consistent with your methods, I consistently get about 50, 000 to 60, 000 stem cells out for mice. I did my PhD in London with Dr.Fiona Wat working on derma stem cells. After that, I just wanted to have a wider knowledge of adult stem cells in various tissues, and so I decided to move to David Kaden lab to work on hematopoietic stem cells, mainly because the things that are known about hematopoietic stem cells are the things that are not known for the epidermic stem cells and a number of assays that can be done with epi.Epidermal stem cells are not really done yet with the hematopoietic stem cells, and so at this point I'm trying to put together the, the knowledge from the two different fields and ultimately I'm interested in the study of the mechanism to regulate adult tissue sensors in general, so not just the epidermis or the stem cells, but also different tissues because there are, there are similar mechanism that is, it's always the same genes that are involved in the regulation that just interact with each other in different ways, and it's just interesting to understand what makes each stem cell be a stem, but then ultimately a stem cell in a different tissue. So giving rise to a different protein.

İzolasyon ve Hematopoetik Kök Hücre Transplantasyonu (HKH&#39;lerin)

Biyoloji

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell therapy may alleviate many of the symptoms associated with lung disease and induce alveolar repair in adults. Concurrent with the ongoing search for stem cells applicable for human treatment, precise delivery and homing (to the site of disease) must be reassured for successful therapy. Here, I report that stem cells can safely be instilled via the trachea opening a non-stop route to the lung. This method involves a skin incision, caudal insertion of a cannula into and along the tracheal lumen, and injection of a stem cell vehicle mixture into airways of the lung. A broad range of media solutions and stabilizers can be instilled via tracheotomy, resulting in the ability to deliver a wider range of cell types. With alveolar epithelium confining these cells to the lumen, lung expansion and negative pressure during inhalation may also assist in stem cell integration. Tracheal delivery of stem cells, with a quick uptake and the ability to handle a large range of treatments, could accelerate the development of cell-based therapies, opening new avenues for treatment of lung disease.

Significant breakthroughs in stem cell identification are continuously being made. To translate these discoveries, however, novel methods for cellular delivery must be devised. Here I report that the airways provide a safe route for stem cell transplantation to the lungs.

Trakeotomi: Akciğer Kök Hücre Nakli Bir Yöntem

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell ...

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastik gömülmesi ve Xenopus laevis Embriyolar Kesit

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

İnsan CD40 aktive B hücreleri üretilmesi

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Transplantasyon Kimerik Zebra balığı Embriyolar Yaratma

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Doku Hedeflenen Embriyonik Chimeras: Zebra balığı Gastrula Hücre Nakli

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Transplantasyon GFP of-Kimerik Zebra balığı Embriyolar Retina ve Beyin Gelişimi Canlı Görüntüleme blastomer ifade

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Model Genetik Organizma olarak kullanmak için Medaka Embriyolar, Mikroenjeksiyon

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...