Cette étude a été soutenue par un National Institutes of Health (NIH) Core Grant (5P30EY008098) et les fonds suivants au XW: des subventions du NIH et de la Recherche R01EY016099 visant à prévenir la cécité Prix du développement de carrière. Nous remercions Lathrop Kira à l&#39;aide de l&#39;imagerie confocale.

Jour 1. Préparation 1. Mettre en place des croix de poisson Mettre en place des croix paires du poisson zèbre dans la soirée. Pour empêcher l&#39;accouplement au hasard avant l&#39;heure désirée, l&#39;utilisation des diviseurs de séparer les poissons féminins et masculins dans les cassettes d&#39;accouplement. Exprimant la GFP poissons transgéniques sont utilisés comme une source de blastomères donateurs. La ligne pt104 transgéniques (Zou et al., 2008), utilisé ici, exprime la GFP omniprésent sous le contrôle du promoteur EF1. Expression de la GFP permet de visualiser les cellules du donneur par imagerie en temps réel. Autres lignes de poissons transgéniques qui expriment des protéines fluorescentes adaptée peut être utilisée pour des besoins spécifiques. 2. Préparer cunéiforme agarose des puits pour la tenue de l&#39;embryon Verser fondu 1% d&#39;agarose, préparée dans de l&#39;eau d&#39;œuf E3 (Westerfield, 2007), dans une boîte de Pétri. Float un moule en plastique qui a des protubérances en forme de coin sur la solution d&#39;agarose et laisser la solution d&#39;agarose complètement solidifié. Retirez soigneusement le moule et plongez le lit d&#39;agarose avec de l&#39;eau E3. 3. Préparer la transplantation d&#39;aiguilles Utilisez un extracteur d&#39;aiguilles verticales (David Kopf Instruments) à réglage de puissance de 11,5 à faire des aiguilles en tirant des pipettes capillaires en verre (instruments de précision du monde). Bonne pointes d&#39;aiguille doit conique avec des arbres de long. Broyer les pointes d&#39;aiguille à un angle de 45 degrés avec un broyeur Micro (Marishige) jusqu&#39;à ce que les ouvertures en biseau de 40 45μm de diamètre interne sont obtenues (figure 1A). Pour nettoyer les pointes d&#39;aiguille, de brancher un tuyau à l&#39;extrémité émoussée de l&#39;aiguille, connecter le tuyau à une seringue, puis aspirer et libérer une solution d&#39;acide fluorhydrique à 10% jusqu&#39;à ce que tous les débris visible est enlevée. Ensuite, lavez les pointes avec de l&#39;eau distillée, suivi par l&#39;éthanol 100%. Sécher à l&#39;air jusqu&#39;à ce que toutes les aiguilles s&#39;évapore éthanol. Il est important de s&#39;assurer que les conseils sont complètement sèches: éthanol résiduel va ruiner les aiguilles lors de l&#39;étape de polissage à haute température. Pour adoucir et polir les aspérités de la pointes d&#39;aiguille, cuire les pointes d&#39;aiguille avec la chaleur générée par le filament d&#39;un faussaire Micro (Marishige). Ne laissez pas les pointes d&#39;aiguille toucher le filament pendant le polissage. La quantité d&#39;électricité passant à travers le filament et la distance entre le filament et les conseils d&#39;aiguille peut être ajustée pour atteindre des conditions de chauffage souhaitée. La température ne doit pas être trop élevée: ce va fondre et déformer les pointes d&#39;aiguille. Après les aspérités sont lissées, touchez délicatement le filament chauffé à la pointe de l&#39;aiguille et tirez doucement le filament loin de l&#39;aiguille pour générer une extrémité pointue (Fig. 1B). Une aiguille fine, lisse et propre est essentiel pour obtenir des blastomères intacts et les donateurs pour ne pas endommager les embryons hôtes. 4. Préparer une sonde embryon positionnement Tirez une pipette en verre sur une flamme de gaz pour obtenir une sonde de verre fines avec une extrémité lisse. Cette sonde sera utilisée pour la position de l&#39;embryon dans le bon sens avant la transplantation. Jour 2. Blastomère la transplantation 1. Recueillir et embryons dechorionate Le lendemain, retirez les diviseurs dans les cassettes croisées pour permettre aux poissons de se reproduire. Placer les embryons dans une boîte de Pétri remplie d&#39;eau E3. Puis, les embryons dechorionate manuellement en arrachant les chorions des embryons avec une paire de pinces fines. Utiliser une pipette en verre avec tige plié soigneusement transférer les embryons dans dechorionated agarose puits. Évitez tout contact de l&#39;embryon avec l&#39;air, qui causent les embryons à éclater. Laissez les embryons se développent à 28,5 ° C dans les puits d&#39;agarose jusqu&#39;à 3 heures après fécondation, ou HPF. 2. Mettre en place un dispositif de transplantation Alors que les embryons se développent, mis en place un dispositif de transplantation par raccordement de l&#39;aiguille de transplantation à l&#39;huile minérale remplie de micro-système de pompage. Assurez-vous que le système ne fuit pas et pas de bulles d&#39;air emprisonnées dans le système. Retour de remplir l&#39;aiguille de transplantation entier avec de l&#39;huile minérale, à l&#39;exception des 0,5 à 1 l de l&#39;espace à l&#39;ouverture. 3. La transplantation de blastomères Pour la transplantation blastomères, l&#39;utilisation d&#39;une sonde de positionnement de verre à orienter le côté blastomère de l&#39;embryon 3-4-HPF vers le haut. Ensuite, insérez l&#39;aiguille greffe dans un embryon de donateurs et lentement sucer 5-20 blastomères dans l&#39;aiguille. Insérez l&#39;aiguille blastomère rempli dans un embryon hôte et libérer les blastomères lentement. Le site sur lequel des blastomères sont libérés va influencer leur progéniture, où localiser à des stades ultérieurs de développement. Pour analyser le développement de la rétine et le cerveau, les cellules libèrent au pôle animal. Pendant la transplantation, assurez-vous que l&#39;aiguille n&#39;entre pas en contact de l&#39;air. Afin de minimiser les dommages mécaniques, des embryons d&#39;accueil doit être laissé dans les puits d&#39;agarose à 28,5 ° C jusqu&#39;au lendemain. Puis, transfert des embryons mosaïque pour plaques de 24 puits pré-enduits avec 0,5 ml d&#39;agarose à 1%, avec un embryon dans chaque puits. 1 ml d&#39;eau oeuf E3 est ajouté à chaque puits. Pour prévenir les infections bactériennes, ajouter 10 l de pénicilline et de streptomycine 100X à l&#39;eau d&#39;œuf E3. Jour 3. Intégration et de l&#39;imagerie en direct d&#39;embryons mosaïques 1. Embryons Embedding Préparer 1,5% d&#39;agarose à faible point de fusion (LMP) dans de l&#39;eau d&#39;œuf E3 et maintenir la solution dans un bain d&#39;eau à 30 ° C. Transfert d&#39;un embryon mosaïque pour une boîte de culture tissulaire FluoroDish avec un fond de verre d&#39;une épaisseur de 0.17mm (instruments de précision du monde). Enlever l&#39;eau excédentaire E3 de quitter l&#39;embryon juste couvertes par un montant minimal de l&#39;E3. Ajouter 30-50 ul LMP fondue de 1,5% à l&#39;embryon. Positionner rapidement l&#39;œil ou le cerveau comme proche du fond de verre que possible avant que la solution d&#39;agarose se solidifie. Après que la solution se refroidit, ajouter des solutions d&#39;agarose pour sécuriser davantage les embryons en place. Ensuite, plonger le bloc solidifié agarose avec 2-3 ml d&#39;eau oeuf E3. 2. Imagerie confocale Pour la microscopie confocale, un objectif à immersion dans l&#39;eau inversé (Olympus, Planapo, 40 X/0.90 WLSM, Japon) avec profondeur de focalisation importante est utilisée. Une goutte d&#39;eau est ajoutée à l&#39;objectif et ensuite placer un plat du tissu FluoroDish la culture sur l&#39;objectif. Pour le développement d&#39;image, effectuez imagerie time-lapse en prenant des photos des embryons toutes les 5 minutes. Selon la nature des expériences, les intervalles de temps entre les prises doit être ajusté. Les résultats représentatifs La figure 2 illustre un représentant de poisson zèbre mosaïque de 24 HPF. Expression de la GFP met en évidence les cellules du donneur dans le vert. Les cellules de la rétine neuro durée de toute l&#39;épaisseur du mur de la rétine. Le film montre les mouvements des cellules du donneur dans le cerveau hôte à 24 HPF. Avis cellules morphologies évoluent avec le temps. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Formes des pointes d&#39;aiguille de la transplantation. A. L&#39;ouverture en biseau de la pointe d&#39;une aiguille était libre de débris après des lavages d&#39;acide fluorhydrique. B. Une extrémité pointue a été généré à la pointe de l&#39;aiguille. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Visualisation des cellules exprimant la GFP donateurs dans un embryons de poissons zèbres chimérique moins 24 HPF. Le panneau de gauche montre les signaux GFP dans le cerveau et la rétine. Le panneau du milieu est une image en champ clair de l&#39;embryon. Le panneau de droite montre l&#39;image fusionnée. Film 1. Live imagerie de cellules GFP positives donateurs a démontré l&#39;étendue des changements dans la morphologie des cellules du cerveau neuroépithéliales cours du développement. Les images individuelles du film ont été recueillies toutes les 5 minutes entre 24 et 25 HPF. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/1924/1924_Wei_Movie1.wmv">Cliquez ici pour voir le film</a> .

<ol>
	<li>Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+RPE+maintained+by+Nok+is+essential+for+retinal+epithelial+polarity+and+cellular+patterning+in+zebrafish.">Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).</li><li>Ho, R. K., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+action+of+zebrafish+spt-1+mutation+in+specific+mesodermal+precursors.">Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors.</a> Nature. 348, 728-730 (1990).</li><li>Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+dou+yan+Mutation+Causes+Patterning+Defects+and+Extensive+Cell+Death+in+the+Retina.">Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina.</a> Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).</li></ol>

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour la transplantation blastomère d&#39;analyser le développement de la rétine et du cerveau chez le poisson zèbre. Ce protocole peut également être utilisé pour analyser le développement des autres tissus et organes, simplement en libérant les blastomères donateurs à des emplacements correspondants dans les embryons hôte. L&#39;étiquetage avec des molécules GFP donne un nettoyant de fond que l&#39;étiquetage avec colorant fluorescent conjugué Dextran (Ho...

L&#39;eau d&#39;œuf E3: <ul><li> 5 mM de NaCl </li><li> 0,17 mM de KCl </li><li> 0,33 mM de CaCl2 </li><li> 0,33 mM MgSO 4 </li><li> Bleu de méthylène 0,1% </li></ul>

transplantation of gfp-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos

Cellules changement abondamment dans leurs emplacements et des biens lors de l&#39;embryogenèse. Ces changements sont réglementés par les interactions entre les cellules et leur environnement. Embryons chimériques, qui sont composés de cellules du fond génétique différent, sont d&#39;excellents outils pour étudier les interactions cellule-cellule médiée par des gènes d&#39;intérêt. La transparence des embryons de poisson zèbre au premiers stades de développement permet la visualisation directe de la morphogenèse des tissus et des organes au niveau cellulaire. Ici, nous démontrons un protocole visant à générer des rétines chimérique et le cerveau chez l&#39;embryon de poisson zèbre et d&#39;effectuer l&#39;imagerie en direct de cellules du donneur. Le protocole couvre la préparation des aiguilles greffe, la transplantation de blastomères exprimant la GFP donateurs à la GFP-négatif hôtes, et l&#39;examen du comportement des cellules des donneurs en microscopie confocale vivre. Avec de légères modifications, ce protocole peut également être utilisée pour étudier le développement embryonnaire des autres tissus et organes chez le poisson zèbre. Les avantages d&#39;utiliser la GFP aux cellules du donneur d&#39;étiquettes sont également discutés.

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Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Nous démontrons un protocole visant à générer des embryons de poissons zèbres chimérique pour l&#39;imagerie cellulaire comportements direct durant l&#39;embryogenèse.

La transplantation de blastomères exprimant la GFP pour l&#39;imagerie en direct sur le développement de la rétine et du cerveau dans les embryons de poissons zèbres chimériques

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.6K vues.  University of Pittsburgh. Nous démontrons un protocole visant à générer des embryons de poissons zèbres chimérique pour l'imagerie cellulaire comportements direct durant l'embryogenèse.

Vidéo: Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Recherche

Biologie

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

En direct l&#39;imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Génération embryons de poissons zèbres chimériques par transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

Développement de l&#39;imagerie automatisée et d&#39;analyse pour les écrans chimiques du poisson zèbre.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Deux-Photon-Based photoactivation dans Live embryons de poissons zèbres

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation d&#39;embryons Medaka et la transplantation de cellules pour la production de chimères

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Glycanes imagerie dans embryons de poissons zèbres par marquage métabolique et Chimie Cliquez Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.