עבודה זו נתמכת על ידי מענק מטעם MRC ל מ FS.

1. התפתחות העוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הם הניחו, ביצים מקובצים בגלל חוטים מצורף על סיסית. כדי לאפשר לפתח עוברים בדרך כלל, יש צורך להפריד ביצים. סבך החוטים וחותכים מצורף ידי החזקת חוטים התקשרות עם שני מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר unclustering, ביצים מופרדות צואה ואצות והועברו בינוני העובר טרי בצפיפות מירבית של 40 ביצים לכל צלחת פטרי 6cm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים Medaka לפתח מעט איטי יותר מאשר דג הזברה ב 27 ° C. העיתוי של הבקיעה שונה בין שני המינים; עוברים medaka בוקעות מן סיסית 7 ימים ומיד מתחילים לשחות ולאכול, בעוד עוברי דג הזברה בוקעות 2 ימים אך מתחילים לשחות ולאכול 5-6 ימים. פיתוח medaka מבוים פי 4 הזמני של Iwamatsu. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפיתוח של עוברים medaka ניתן להתאים בנוחות תוכניות ניסיוניות ידי בחירת הטמפרטורה המתאימה. פיתוח של עוברים medaka ניתן עצרה 4 ° C בהתפתחות המוקדמת. אחרי שלב 24 כאשר הלב פועם מתחיל, פיתוח יכול להיות האטה באמצעות טמפרטורת מינימום של 18 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיתוי הופעתו של איברים / רקמות היא מעט שונה medaka לעומת דג הזברה, כלומר somitogenesis medaka מתרחשת לאחר תחילת התפתחות המוח ואילו somitegenesis דג הזברה מקדים להתפתחות המוח. </li></ol> 2. הסרת סיסית סיסית של medaka מורכב משתי שכבות מגן בשכבה הפנימית קשה משטח רך החיצונית. לכן, טיפול שני שלבים פרוטאז העסקת pronase ואת האנזים הבקיעה יש צורך להסיר סיסית. Dechorionated פעם, עוברים יש לשמור 1X BSS. חצי סטרילי תנאי ישפר את תרבות מוצלחת של העוברים dechorionated, במיוחד כאשר תקופות ארוכות יותר של התבוננות נדרשים. פתרונות אלה כוללים שימוש סטרילי (למשל עיקור 1X BSS עם אנטיביוטיקה) וכלים מעוקרים אתנול עם 70% ואחריו שטיפה 1X BSS. כפי dechorionated עוברים medaka הם רך ושברירי יותר עוברי דג הזברה dechorionated, משנה זהירות יש לנקוט כדי להבטיח שהם לא פנה אוויר או בועות פיפטה, כמו זה יגרום קריסה מיידית. כדי להבטיח פגיעה מזערית עוברים, פעורת פה זכוכית מלוטשת עם משאבת חום פיפטה פיפטה יש להשתמש בעוברים העברת לולאה השיער צריך להיות מנוצל כדי להתמצא עוברים לצורך השגחה. Non-חסיד צלחות פטרי צריך לשמש כדי למנוע מן העוברים הצמדת משטחים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני dechorionation זה יש לבדוק כי ביצים שהופרדו מספיק וניקה-up. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז הן pronase ואנזימים הבקיעה הם proteinases, הם צריכים להיות כל הזמן על הקרח לצמצם את החשיפה של עוברים אלה אנזימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ביצים נייר זכוכית (p2000 בגודל חצץ, עמיד למים) להציב מכסה של צלחת פטרי 9cm. הסר בינוני עודף אלא להבטיח נפח מספיק נשאר כדי למנוע ייבוש של עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלגל בעדינות עוברים כ 45-60 שניות כדי להסיר כמה שערות המשטח החיצוני קלות ציון את פני השטח של סיסית (איור 1). העברת עוברים בחזרה צלחת פטרי המקורית ולבחון. כאשר עוברים מתגלגל על ​​נייר זכוכית להשתמש באצבע, הפעלת לחץ מינימלי ושמירה במקביל אצבע על פני השטח של נייר חול. אל רול יותר עוברים 5-7 בבת אחת. זהירות זה יהיה למזער את הסיכון של ריסוק עוברים מתחת לזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני ביצה בצלחת עם pronase 20mg/ml ועוברים דגירה של 40-60 דקות על 27 ° C. ודא עוברים מכוסים דיים על ידי pronase ואת מכסה קיים על המנה. Pronase שאינם בשימוש יש לשמור על הקרח במהלך שלב זה כדי למזער עצמית העיכול ניתן לעשות שימוש חוזר עד פעילות אבוד (כ 1-2 שבועות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזור pronase לשימוש חוזר ועוברים לשטוף 5X במדיום העובר כדי להסיר עקבות של pronase כמו זה יהיה להשבית את האנזים הבקיעה להתווסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני העובר ועוברים לכסות עם האנזים הבקיעה, הבטחת עוברים לשבת כמו monolayer בצלחת. אם יש ביצים לשבת על גבי אחד לשני בצלחת, אלה שבתחתית יהיה מעוך כמו סיסית נמס. שמור אנזים הבקיעה בשימוש על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור העוברים על 27 מעלות צלזיוס, לאחר 15 דקות לבדוק מעת לעת את התקדמות הבקיעה באמצעות stereomicroscope. זה יהיה לראות כי מספר הירח מכתש כמו חורים מתחילים להופיע בשכבה הפנימית של סיסית, אשר בקרוב מתמוסס הבאה זה משאיר השכבה החיצונית הרכה של סיסית להסיר בקלות manuallי &#39; כל התהליך של הבקיעה עלול לקחת 15-60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע עוברי לצאת מן סיסית, העברת העוברים על צלחת פטרי המכילה 1X BSS. ודא שלא להעביר אנזים הבקיעה את BSS 1X ידי נגיעה קצה פיפטה על פני השטח של BSS המאפשר העוברים בעדינות לרדד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל העוברים מועברים אנזים הבקיעה, לבצע העברה הסופי מאכל אחר טריים של 1X BSS. זה מבטיח עוברי לא נחשפים כל שאריות האנזים הבקיעה, כמו זה יהיה נזק עוברי חשוף. לאחר בצלחת זה סופי כל עוברי עדיין בעל השכבה החיצונית של סיסית יכול להיות משוחרר באופן ידני באמצעות עיקור מיקרו מלקחיים תחת stereomicroscope. אם עוברים צריך להיות מפותח dechorionation הבאים, פניצילין / סטרפטומיצין יש להוסיף את BSS כדי למנוע התפתחות חיידקים. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. השוואה בין עוברים התגלגל פרשו במהלך dechorionation. שים לב כיצד עוברים התגלגל B פאנל העדר שערות לראות על עוברי פרש בלוח א 3. עוברים dechorionated הרכבה הטבעה agarose שימושית עבור תקופות ארוכות יותר של הדמיה (למשל זמן לשגות הדמיה) עבור עוברים לחיות כמו גם תצפיות מפורטות של עוברים קבוע. במהלך gastrulation ו organogenesis מוקדם (שלב 14 שלב 28), עוברים medaka התערוכה גלים של תנועות התכווצות קצבית ברחבי periderm, שכבת רקמה המכסה גם את העובר המתפתח ואת חלמון 5. עוברים מטופלים עם 3.5mm 1-heptanol להפסיק תנועות התכווצות 6. כדי לעצור את התנועה של העוברים לאחר שלב 28 (64hpf), עוברים הם מורדמים ידי הוספת טיפות Tricaine mesilate (TMS) לפני ההטבעה. TMS תתווסף גם agarose (רק להוסיף כמות מזערית, מינון זה צריך להיות מותאם, כ דילול 01:25). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי כמות קטנה של 3% נמוך הטמפרטורה gelling agarose (ב 1X BSS) על ידי חימום ל 37 ° C ולשמור על בטמפרטורה הזאת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלבים הבאים צריכים להתבצע במהירות על מנת להבטיח כי agarose לא לפני orientating לחזק את העובר. שימוש פעורת פה פיפטה זכוכית מותכת העברת agarose מספיק כדי למלא את המכסה של דיכאון צינור Eppendorf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה חד העובר dechorionated לדיכאון את הכובע מזעור נושאת על BSS עם העובר. מיד ספיגת agarose ואת העובר מדיכאון את הפקק להעביר קאמרית תרבות צלחת פטרי. צלחת פטרי 3.5cm עם חלון זכוכית בתחתית משמש. עבור דימות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה, הם עוברים על הבטן הגוף חוקיים והניח קרוב זכוכית המכסה. עבור דימות באמצעות מיקרוסקופ זקוף, עובי של agarose ממוזער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את צלחת פטרי 3.5cm לתוך צלחת 14cm קוטר פטרי המכילה קרח ומים (מים מלאים עד עומק סך בערך 1 / 3 של צלחת גדולה). בעוד מחזיק את החדר בחוזקה על החלק התחתון של צלחת פטרי 14cm, להשתמש לולאה השיער בעדינות כדי להתמצא העובר כרצונכם ב agarose מותכת והחזק את העובר עד agarose מבצרת בעדינות על ידי העלאת והורדת את צלחת קטנה יותר למיקום המקורי שלה במים קרים כקרח. </li></ol> 4. השתלת תאים בעוברים medaka מטרת הליך זה היא לקבוע האם הגן של עניין מעשי התא באופן עצמאי (בתוך תא) או אי התא באופן עצמאי (בין תאים). תאים התורם יכול להיות מתויג עם צבע נותב כגון rhodamine-dextran לפני השתלה (כפי שמתואר &quot;Microinjection עוברים Medaka&quot; הפרוטוקול הנלווה יופיטר) או זן מהונדס עם ביטוי של GFP עשוי להיות מנוצל, המאפשר הערכה השתלה. שילוב של שתי הטכניקות תיוג לעיתים קרובות כדאי להתגבר אוטומטי הקרינה שניתן נתקל. במשך זמן לשגות המחקרים הבאים השתלה, ביטוי של GFP הוא שימושי במיוחד. השתמש פיפטה פעורת פה זכוכית עם משאבה פיפטה בכל הליך זה לעקר את כל הכלים (כולל שקופיות) מראש EtOH עם 70% ואחריה לשטוף היטב סטרילי 1X BSS. עוברים נמען מפותחים בדרך כלל סביב 12 הבמה כמו זו מאפשרת הפליה של הקטבים הגחון ועל הגב בעת ביצוע ההשתלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל dechorionating עוברים 1.5 שעות לפני השתלת הזרקת מנגנון ההתקנה במהלך incubations האנזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מיקרוסקופ חלל להחליק לתוך צלחת פטרי בקוטר 9cm. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת כמות קטנה של 3% methylcellulose למרכז השקופית חלל באמצעות קצה פיפטה סטרילית להפיץ דק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Methylcellulose יבש למשך כ 1-2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 350μl של סטרילית 1X BSS למלא דיכאון שקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה חד העובר התורם עד ארבעה עוברי הנמען לשקופית באמצעות פיפטה מזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים להתמצא באמצעות לולאה השיער כך blastoderm העובר פונה מעלה. עוברים ניתן נשען אחד נגד השני ליציבות עלייה נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס בעדינות את המחט מיקרו לתוך blastoderm התורם לאט ספיגת 10-20 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס בעדינות מחט לאזור הנדרש blastoderm העובר מקבל ולגרש את התאים לאט. בזהירות רבה יש לנקוט בעת הוספת תאים לתוך blastoderm הנמען כדי לא לשבש את התא שק חלמון גבול כמו זה יהיה לגרום למוות של העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים מעוקרים 1X BSS לתוך צלחת פטרי. בזהירות לצקת את BSS לתוך צלחת קרוב לצד המנה ככל האפשר, כדי לא לשבש את העוברים. לא לשפוך את BSS ישירות על העוברים ולהוסיף BSS מספיק כזה שקופיות עוברים שקועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100μl של סטרפטומיצין / פניצילין כדי בצלחת ומכסים. בזהירות כדי להעביר צלחת 27 ° C בחממה כדי לאפשר התפתחות תקינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים ניתן להבחין מדי פעם לפי הצורך. בעת השימוש השתלת לבצע ולהשיג-of-פונקציה ו / או להציל ניסויים פנוטיפ, כמה שינויים מורפולוגיים נצפתה יכול להיות בגלל ההשפעות של השתלה. כך מספר השתלות נחוצים. לאחר 2-3 ימים, melanophores צריך להיות נוכח על שק החלמון, הראש, העיניים המטען. אם נוכח העוברים המושתלים על כך מוצלח הכימרה יש ככל הנראה יוצרו (איור 3). </li></ol> אם התורם הצורך, גנוטיפ העובר (ים) על ידי העברת צינור PCR (ים) המכיל 25μl של 20mg/ml proteinase ק לדגור על 55 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות ואחריו 10 דקות 94 ° C ו לבצע PCR. 5. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. בעמדה דוגמה של העובר agarose-מוטבע. Anterior מוצג מימין ולהציג היא הגב. לוח ב &#39;: לתאי אנדותל ניתן לראות משני צדי הגוף העובר מסומנים בעזרת ה-GFP מונע על ידי האמרגן fli. <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. תמונות של הפוסט השתלת עוברים. תמונה מראה העובר התורם והמקבל מיד לאחר ההשתלה. העובר התורם מוצג בצד ימין עם blastoderm אדום לחלוטין (חץ). העובר מקבל מוצג משמאל מזוהה בקלות על ידי המסה קטנה של התאים המושתלים אדום גלוי blastoderm (ראש חץ). תמונה ב &#39;מציגה שני עוברי מקבל כ -7 שעות לאחר ההשתלה (מודגרות ב 27 ° C). שימו לב התאים המושתלים היגרו מהאתר של השתלת מפוזרים כיום ברחבי blastoderm (חיצים). תמונה ג&#39;מציגה העובר מקבל את st.29 (כ 74hpf). שים לב פיגמנטציה בעיניים את הנוכחות של melanophores באזור תא המטען המוח (חיצים). Rhodamine שכותרתו התאים ניתן לראות להיות מיישבים רבים של מבנים עובריים המציין את ייצור מוצלח של תעתוע.

<ol>
	<li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka,+Oryzias+latipes.">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li><li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka+and+zebrafish,+an+evolutionary+twin+study.">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech Dev. 121, 629-6237 (2004).</li><li>Hirose, Y., Varga, Z. M., Kondoh, H., Furutani-Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+lineage+and+regionalization+of+cell+populations+during+Medaka+neurulation.">Single cell lineage and regionalization of cell populations during Medaka neurulation.</a> Development. 131, 2553-2563 (2004).</li><li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes.">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Zool Sci. 11, 825-839 (1994).</li><li>Cope, J., Fluck, R., Nicklas, L., Plumhoff, L. A., Sincock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stellate+layer+and+rhythmic+contractions+of+the+Oryzias+latipes+embryo.">The stellate layer and rhythmic contractions of the Oryzias latipes embryo.</a> J Exp Zool. 254, 270-275 (1990).</li><li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Whole+Mount+High-Resolution+Double+Fluorescent+In+Situ+Hybridization.">Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך dechorionate ולבצע transplanataion על תא עוברי medaka. זוהי טכניקה רבת עוצמה כדי לייצר עוברים chimeric לחקר תפקוד הגנים / חלבון במהלך הפיתוח, כמו גם הבהרת את האוטונומיה של הגן / החלבון המדובר. Medaka הם מערכת מודל שימושי עבור החולייתנים טכניקה זו עקב מפות גורל מבוססת היטב ההלוואות שלהם שקיפות אותם היטב בתחום ההדמיה בזמן אמת vivo. השתלה ניתן לשלב עם microinjection (כפי שמתואר &quot;Microinjection של Medaka עוברים&quot; הפרוטוקול הנלווה יופיטר) כך את התנהגותו של התאים המושתלים ניתן להבחין בקלות.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Embryo medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Made in-house</td>
<td>N/A</td>
<td>200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water.)</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro-dissecting forceps</td>
<td>Tools</td>
<td>55 INOX A.DUMONT&amp;FILS</td>
<td>N/A</td>
<td>Very sharp fine tips for removal of chorion.</td>
</tr>
<tr>
<td>Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size</td>
<td>Tools</td>
<td>Hermes Abrasives Ltd.</td>
<td>N/A</td>
<td>Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions.</td>
</tr>
<tr>
<td>3% methylcellulose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M 0512</td>
<td>High viscosity for holding embryos in place during transplantation.</td>
</tr>
<tr>
<td>1X BSS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Made in-house</td>
<td>N/A</td>
<td>20XBSS: 130g NaCl, 8g KCl, 4g MgSO4.7H2O, 4g CaCl2.2H2O, and 10mg Phenol Red in 1L MilliQ water and autoclave; 500mM Hepes in MilliQ water autoclaved. Add 25ml 20XBSS and 15ml 500ml Hepes pH7.0, fill up to 500ml and filter sterilize before use.</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140-122</td>
<td>Added to BSS when incubating dechorionated embryos.</td>
</tr>
<tr>
<td>Pronase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>53702</td>
<td>For dechorionation.</td>
</tr>
<tr>
<td>Hatching enzyme</td>
<td>Reagent</td>
<td>Made in-house</td>
<td>N/A</td>
<td>For dechorionation.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tricaine mesilate (TMS)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-5040</td>
<td>400mg tricaine in 97.9ml distilled water and 2.1ml 1M Tris, pH adjusted to 7; 4.2ml of this solution in 100ml clean tank water.</td>
</tr>
<tr>
<td>3% ultra-low gelling temp. agarose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-2576</td>
<td>Type IX-A. Used during embedding of embryos for observation.</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dish culture chamber</td>
<td>Tool</td>
<td>Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.</td>
<td>11-004-008</td>
<td>Iwaki glass base dish 35mm with 12mm window. Used during embedding of embryos for observation.</td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Narishige</td>
<td>N/A</td>
<td>Model MN151. For removal and insertion of cells during transplantation.</td>
</tr>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>GC100-10T</td>
<td>For making transplantation needles.</td>
</tr>
<tr>
<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>Model P-97 </td>
<td>For making transplantation needles.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

dechorionation of medaka embryos and cell transplantation for the generation of chimeras

Medaka הוא דג קטן ההטלה מים מתוקים המאפשר ניתוח הן גנטיות העוברית והיא אחת משלוש חוליות אורגניזמים מודל שבו הגנום כולו פנוטיפ מונחה מסכי מוטציה בוצעו 1. החפיפה סטייה תפקודית של גנים הקשורים בין medaka ו דג הזברה מאפשר זיהוי של פנוטיפים רומן כי הם ניתנים לזיהוי ב זן יחיד 2, ובכך medaka ו דג הזברה משלימות לניתוח גנטי של פונקציות הגנום החולייתנים. מניפולציה של עוברים medaka, כגון dechorionation, עוברים הרכבה עבור הדמיה השתלת תאים, הם הליכים מפתח לעבוד על שניהם medaka ו דג הזברה במעבדה. השתלת תאים בוחן אוטונומיה תא של מוטציות medaka. מפלצות נוצרות על ידי השתלת תאים מעוברים שכותרתו התורם לעוברי הנמען ללא תווית. תאים התורם ניתן להשתיל לאזורים מסוימים של עוברי הנמען מבוסס על גורל מפות 3 כך שיבוטים של התאים המושתלים יכולים להיות משולבים ברקמות של עניין במהלך הפיתוח. בשל סיסית הקשיח עוברים רך, מניפולציה של עוברים medaka מעורב יותר מאשר דג הזברה. בסרטון הזה, אנו מראים נהלים מפורטים לתפעל עוברים medaka.

Watch this Scientific Journal Video about Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras at JoVE.com

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

בשל סיסית הקשיח עוברים רך, מניפולציה של עוברים medaka מעורב יותר מאשר דג הזברה. וידאו זה מציג צעד אחר צעד נהלים כיצד לתפעל עוברים medaka, כולל dechorionation, גובר agarose עבור הדמיה השתלת תאים לייצור מפלצות. נהלים אלה הם חיוניים כדי להשתמש medaka ו דג הזברה במעבדה כדי לנצל את מלוא היתרונות של התכונות המשלימות שלהם לנתיחה הגנטי של פונקציות הגנום החולייתנים.

Dechorionation עוברים Medaka והשתלות Cell עבור דור של מפלצות

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

dechorionation-medaka-embryos-cell-transplantation-for-generation

Research

JoVE Journal

Biology

17.6K Views.  University of Bath. בשל סיסית הקשיח עוברים רך, מניפולציה של עוברים medaka מעורב יותר מאשר דג הזברה. וידאו זה מציג צעד אחר צעד נהלים כיצד לתפעל עוברים medaka, כולל dechorionation, גובר agarose עבור הדמיה השתלת תאים לייצור מפלצות. נהלים אלה הם חיוניים כדי להשתמש medaka ו דג הזברה במעבדה כדי לנצל את מלוא הי...

Video: Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

I am Christina Ceso. I am a postdoc in David's Den lab and I work on the hematopoietic stem cells. Today we are going to purify long-term recuperating hematopoietic stem cells and we'll transplant them into a mouse.We start by spraying the mice with alcohol so that first of all, the mind starts sterilized and also the hair doesn't interfere with the dissection. We use PBS with 2%serum for the dissection. I cut the back skin and I pull the skin apart in order to expose the tissue.In order to isolate the tibia, I hold the tibia with tweezers. I cut the tendon on top of the knee and I cut the muscles below the knee and after that I cut through the knee so that the TBI is not connected to the rest of the limb anymore and I pull in order to isolate it. I then hold the TB upside down and with the scissors I separate the foot from the tibia In order to obtain the femur.I cut the muscles around the femur and then I dislocate the femur from the hip. In order to isolate the hip, I cut the muscle around the hip bone on the side of the tail of the mouse and then I pull the hip away from the body of the mouth In order to isolate the spine. I cut through the tail as close as I can to the beginning of the back and then I cut on the two sides of the spine and below the spine, trying to stay as close as possible to the spine so that the peritoneum is not cut and the intestine is left untouched.A first round of cleaning of the bones is done with a scalpel, which is used to scrape the bone, the muscles away from the bone. The scalpel is good to clean the femurs, the hip and the spine. In order to clean the tibia, I hold them with forceps and I use the forceps to remove as much tissue as possible.A second round of cleaning is done using clean wipe to completely clean the bones outta the muscle, and I use the F wipe to clean the tibia, the femurs and the hips. So this is how bones look. After cleaning, I prefer 50 amount tubes with filters on top and I transfer the bones into the mortar.I add the section media and I crush the bones ask of the first round of crashing of the bones. I piped the mixture in order to release as many styles as possible into solution and reduce clumps. I transferred the mixture on the tubes through the filters and this is what the bone fragments look like after the first round of crushing.So I add more dissection medium to the bone fragments and I flash them again. I transferred the seline mixture to the tubes through the filters and at this point the remaining bone fragments are white and there is no bone marrow left. The tubes are filled with PBS 2%serum and in order to have them all with the same weight so that they're balanced in the centrifuge, but also in order to wash the filters so that we obtain as many cells as possible, I then centrifuge the cell mixture and after centrifugation, the palt includes the bone marrow cells.I aspirate the medium and I move back and forward the tube on the rack so that the pelle is becomes loose and fewer clamps are formed. When I add medium, at this point I add one ml of medium per tube and I ics since I'm sorting hematopoietic stem cells. Later on, I'm going to store an ALI output of total bone marrow sizes at this point, which I will use later for the fact single color control.I add lineage antibody cocktail. I ordered the samples to mix them well and I invaded four degrees for 15 minutes. In the meantime, I start preparing the columns for the lineage division.I put the columns on the magnet and I prepare Ian tubes under the columns. I also prepared the gas PBS using aster flip filter and attaching it to the vacuum so that all the bubbles of air move in the top part of the filter. I then add three ml of the gas DBS to each column in order for the column to become wet.After the incubation with the antibodies, I add medium to the cell samples and I centrifuge them in order to remove the excess of antibodies. After the centrifugation, the stain cells are in the pallet. I aspirate the medium and I suspend the pallet in one mile of the gas PBSI Add the strip tab beans, I mix the cells and I incubate for 15 minutes at four degrees.After the incubation, I put new elucian tubes under the columns. I add two ml of PBS to each tube with the cells and I transferred the cell mixture to the column through a 40 micron filter. I wash the tubes with more medium in order to collect all the cells remaining and I apply the remaining medium through the filters to the columns.The progenitor cells lineage low are alluded into the collection views. I pulled the luted samples and I sent tofu them. So after the centrifugation, the depleted cells are in a white pate.I aspirate the medium and re suspend the cells. I store an adequate of the depleted cells and I add the antibodies to the cell mixture for the sorting and also to all the single color controls. The antibodies are incubated in that with the size for 15 minutes in the fridge.After the ation, I add medium to the cells and and centrifuge them to remove the ex excess of antibodies. After the centrifugation, the cells are in the pt, I aspirate the media that I suspend the cells and I transfer the cells into fox tubes with a blue filter. At this point, the cells are ready to be sorted.I place, I place the mouse under a heating lamp for a few minutes so that the veins dilate and they are more easily seen. When preparing the syringe, you have to be careful to eliminate all the bubbles from the, the mixture that is in the syringe and then you bend the needle at 90 degrees. I put the mouse under a glass cup with a weight on top so that it can run away.I sterilize the tail with the alcohol pad so that the site of injection is sterile, but also it's easier to identify the vein. If you look at the tail of the mouse from the top in the middle and top of the tail, there is an artery while on the two sides there are the two veins and we inject the cells in one of the two veins. I insert the needle into the vein and I inject following injection.It is to wait for a couple of seconds before removing the needle, the needle, and after that I clean the side of injection. This is a representation of the syringe with the ben needle bent at 90 degrees with the knee, the at this ankle compared to the tail, which makes the injection the easiest. When you injecting the tail of the mouse, you have to keep in mind that the tail vein is extremely superficial, so really this is the orientation of the needle compared to the tail.And it looks like you will just keep sliding on top of the tail, but actually you will get into the tail then. I am Christina Ceso. I am a post in David Kaden lab, and I work on the hematopoietic stem cells.I usually use for animals to start with, and I had more variability at the beginning, but once you become consistent with your methods, I consistently get about 50, 000 to 60, 000 stem cells out for mice. I did my PhD in London with Dr.Fiona Wat working on derma stem cells. After that, I just wanted to have a wider knowledge of adult stem cells in various tissues, and so I decided to move to David Kaden lab to work on hematopoietic stem cells, mainly because the things that are known about hematopoietic stem cells are the things that are not known for the epidermic stem cells and a number of assays that can be done with epi.Epidermal stem cells are not really done yet with the hematopoietic stem cells, and so at this point I'm trying to put together the, the knowledge from the two different fields and ultimately I'm interested in the study of the mechanism to regulate adult tissue sensors in general, so not just the epidermis or the stem cells, but also different tissues because there are, there are similar mechanism that is, it's always the same genes that are involved in the regulation that just interact with each other in different ways, and it's just interesting to understand what makes each stem cell be a stem, but then ultimately a stem cell in a different tissue. So giving rise to a different protein.

בידוד והשתלות של בתאי גזע hematopoietic (HSCs)

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell therapy may alleviate many of the symptoms associated with lung disease and induce alveolar repair in adults. Concurrent with the ongoing search for stem cells applicable for human treatment, precise delivery and homing (to the site of disease) must be reassured for successful therapy. Here, I report that stem cells can safely be instilled via the trachea opening a non-stop route to the lung. This method involves a skin incision, caudal insertion of a cannula into and along the tracheal lumen, and injection of a stem cell vehicle mixture into airways of the lung. A broad range of media solutions and stabilizers can be instilled via tracheotomy, resulting in the ability to deliver a wider range of cell types. With alveolar epithelium confining these cells to the lumen, lung expansion and negative pressure during inhalation may also assist in stem cell integration. Tracheal delivery of stem cells, with a quick uptake and the ability to handle a large range of treatments, could accelerate the development of cell-based therapies, opening new avenues for treatment of lung disease.

Significant breakthroughs in stem cell identification are continuously being made. To translate these discoveries, however, novel methods for cellular delivery must be devised. Here I report that the airways provide a safe route for stem cell transplantation to the lungs.

הקנה: שיטה להשתלת בתאי גזע כדי ריאות

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell ...

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

פלסטיק הטבעת ואת חתך של עוברים Xenopus laevis

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

יצירת עוברים דג הזברה chimeric על ידי השתלה

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

ממוקד רקמות מפלצות עובריים: דג הזברה Gastrula השתלת תאים

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjection עוברים Medaka לשימוש כמודל אורגניזם גנטי

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...