Ce protocole permet de manipuler des protéines, ou expression de microARN, dans des adipocytes différenciés pour étudier leur rôle dans la fonction des adipocytes. Cette méthode de transfection inverse est une méthode simple, économique et très efficace pour transfecter des oligonucléotides dans des adipocytes 3T3-L1 de souris. Cette méthode peut également être appliquée aux préadipocytes humains différenciés en adipocytes.
La démonstration de la procédure sera faite par Melanie Gaudfrin, une technicienne de notre laboratoire. Cultivez les fibroblastes 3T3-L1 dans des plats de 100 millimètres dans le DMEM sans pyruvate, 25 millimolaires de glucose, 10% de sérum de veau nouveau-né et un pour cent de pénicilline et de streptomycine. Placez les plats dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et sept pour cent de dioxyde de carbone.
Deux jours après la confluence, changez le milieu de culture, en le remplaçant par du DMEM sans pyruvate, 25 millimolaires de glucose, 10% fcS et un pour cent de pénicilline et de streptomycine complétés par 0,25 millimolaire IBMX, 0,25 micromolaire dexaméthasone, cinq microgrammes par millilitre d’insuline et 10 rosiglitazone micromolaires. Incuber les plats pendant deux jours. Deux jours plus tard, remplacez le milieu de culture par du DMEM sans pyruvate, 25 millimolaires de glucose, 10% FCS et un pour cent de pénicilline et de streptomycine complétés par cinq microgrammes par millilitre d’insuline et 10 rosiglitazone micromolaires et incuber pendant deux autres jours.
Nourrissez les cellules tous les deux jours avec du DMEM sans pyruvate, 25 millimolaires de glucose, 10% FCS et un pour cent de pénicilline et de streptomycine et gardez les cellules dans l’incubateur. Un jour ou quelques heures avant la transfection, préparer une solution de collagène de type I à 100 microgrammes par millilitre dans de l’éthanol à 30% à partir d’une solution type à un milligramme par millilitre. Ajouter 250 microlitres de collagène par puits d’une plaque de 12 puits ou 125 microlitres par puits d’une plaque de 24 puits et étaler la solution sur la surface du puits.
Laissez la plaque sans couvercle sous la hotte de culture jusqu’à ce que le collagène sèche. Ensuite, lavez-le deux fois avec D-PBS. Pipettez le siRNA avec un milieu essentiel minimum amélioré pour mélanger et incuber pendant cinq minutes à température ambiante.
Ajouter le réactif de transfection et le milieu essentiel minimal amélioré à l’ARNi et à la pipette à mélanger. Incubé pendant 20 minutes à température ambiante. Ajoutez ensuite le mélange de transfection à chaque puits de la plaque recouverte de collagène.
Lavez les cellules dans la boîte de Petri de 100 millimètres deux fois avec D-PBS. Ajoutez 5x trypsine aux cellules, en vous assurant de couvrir toute la surface avec la trypsine. Attendez 30 secondes et retirez soigneusement la trypsine.
Incuber la boîte de Petri pendant cinq à 10 minutes à 37 degrés Celsius dans l’incubateur. Ensuite, tapotez le plat pour détacher les cellules, en évitant les dommages cellulaires. Ajouter 10 millilitres de DMEM sans pyruvate, 25 millimolaires de glucose, 10% FCS, et un pour cent de pénicilline et de streptomycine pour neutraliser la trypsine.
Pipettez soigneusement le milieu de haut en bas pour détacher les cellules et homogénéiser la suspension cellulaire. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage Malassez ou d’un compteur cellulaire automatisé et ajustez la concentration des cellules à 0,625 million de cellules par millilitre de milieu. Ensemencez 800 microlitres de la suspension cellulaire par puits d’une plaque de 12 puits ou 400 microlitres de la suspension cellulaire par puits d’une plaque de 24 puits contenant le mélange de transfection.
Incuber les plaques dans un incubateur de culture cellulaire et ne pas les déranger pendant 24 heures. Le lendemain, remplacez soigneusement le surnageant par du DMEM frais sans pyruvate, 25 millimolaires de glucose, 10% fcS et un pour cent de pénicilline et de streptomycine et retournez les cellules à l’incubateur. Les points de temps typiques pour détecter l’argnement de la cible après l’administration de siRNA ou de miR sont de 24 à 48 heures pour l’ARNm et de 48 à 96 heures pour les protéines.
Des expériences fonctionnelles peuvent être effectuées sur des adipocytes transfectés, y compris la signalisation de l’insuline, l’absorption du glucose, la sécrétion d’adipokine, la lipolyse et la lipogenèse. Il a été démontré que les adipocytes préservent leur morphologie après la transfection. Deux jours après la transfection, les adipocytes présentaient des gouttelettes lipidiques multiloculaires dont la teneur en lipides n’était pas différente entre les adipocytes transfectés et non transfectés.
L’expression de l’ARNm de divers marqueurs de différenciation était inchangée dans les cellules transfectées par rapport à celle des adipocytes non transfectés. Le protocole de transfection inverse est efficace car plus de 70% des adipocytes ont été transfectés. Trois jours après la transfection avec siRNA contre La périlipine-1, le niveau d’ARNm de perilipine-1 avait diminué de 70% et le niveau de protéine de 63% L’expression de perilipine-1 a également été analysée par microscopie à fluorescence quatre jours après la transfection et s’est avérée avoir diminué de 92% par rapport à son expression dans les adipocytes témoins.
La transfection inverse des adipocytes avec des microARN imitant les oligonucléotides pour réguler à la hausse l’expression de miR-34a est montrée ici. La sur-expression de miR-34a a conduit à la diminution de l’expression de la protéine VAMP2 de 50% L’élimination de la périlipine-1 dans les adipocytes 3T3-L1 a entraîné une augmentation de la lipolyse basale tandis que la sur-expression de miR-34a a conduit à l’inhibition de la phosphorylation de la protéine kinase B induite par l’insuline et de l’absorption du glucose. Il est important d’atteindre un niveau élevé de différenciation des adipocytes pour effectuer la transfection sur les adipocytes nouvellement différenciés et de surveiller attentivement le traitement des adipocytes avec de la trypsine.
Après la transfection, il est possible d’effectuer des expériences fonctionnelles sur les adipocytes pour étudier l’impact des protéines ou de la manipulation des microARN sur la signalisation de l’insuline, l’absorption du glucose, la lipogenèse et la lipolyse.
