1. Préparation des échantillons <ol><li> Diluer la suspension de cellules avec ORFLO diluant ou un diluant approprié de sorte que la concentration cellulaire se situe dans la plage de fonctionnement de l&#39;instrument (3000 à 500 000 cellules par millilitre de type M de cassette ou de 3000 à 2.500.000 cellules / mL dans la cassette de type S). </li><li> Une dilution de 1:5 à 1:20 (Type M cassette) ou pas de dilution à 1:5 de dilution (cassette de type S) est recommandé pour les lignées cellulaires de mammifères les plus, mais la dilution appropriée dépendra du type de cellule et de la densité de semis. Le volume nécessaire pour un décompte précis est d&#39;environ 75 pi. </li></ol> 2. Le traitement des échantillons <ol><li> Tournez le Z Moxi en appuyant sur ​​le bouton d&#39;alimentation et de l&#39;écran d&#39;accueil s&#39;affiche. </li><li> Appuyez sur le plateau vers le bas et insérez une cassette dans le Z. Moxi L&#39;échantillon pipette 75μL ... l&#39;écran sera affiché. </li><li> Pipeter un échantillon 75 pL dans l&#39;orifice de remplissage de la cassette (ovale bleunumérotés de 1 ou 2, selon le fin de la cassette a été insérée dans l&#39;instrument). Ce sont des cassettes jetables, qui peuvent être utilisés pour les tests 2. Remarque: Placez la pointe de pipette directement dans le chargement et à ~ 45 ° angle de sorte que la pointe est pris sous la lèvre avant du puits. Lors de la distribution, il est important que le vide n&#39;est pas «aller de l&#39;avant» de la distribution du fluide que pourrait causer des poches d&#39;air d&#39;entrer dans la cassette. Il est recommandé d&#39;avoir une petite perle (la taille de l&#39;entrée ainsi) de la forme liquide sur le bien pendant la distribution. </li><li> Pour le comptage des cellules de mammifères les plus, touchez l&#39;écran n&#39;importe où pour commencer. Pour le comptage des particules très petites (de 4 à 8 um de diamètre en moyenne pour le type M et 3-8 um de diamètre en moyenne pour le type S), le Z Moxi peut être exécuté en mode petites particules. Note: le type de cassette est indiqué dans la barre noire dans la partie supérieure de l&#39;écran. Dans ce mode, Moxi Z définit l&#39;échelle de diamètre de 2 à 10 um que la valeur par défaut, et réalise la numération uchanter paramètres optimisés pour la détection de petites cellules. Appuyez sur la touche TOUCH voici un petit bouton Mode de particules (carré noir) pour lancer le test et exécuter dans ce mode. </li><li> Le Z Moxi va commencer le test et les résultats de comptage de cellules sera terminée en environ 8 secondes (type M cassette) ou 15 secondes (cassette de type S). </li><li> Le ajustement de courbe et calculs MVI commencer automatiquement et ne nécessitent que quelques secondes supplémentaires. Quand un ajustement approprié est trouvé, les résultats seront alors automatiquement affichée sur l&#39;écran. </li><li> Pour faire Gating le mode d&#39;acquisition par défaut, appuyez sur la courbe d&#39;ajustement sur ​​le bouton pour basculer le comte en mode d&#39;ouverture de porte. </li><li> À ce stade, la cassette peut être enlevée de l&#39;unité. </li></ol> 3. Gestion des données <ol><li> Si l&#39;échelle AutoMode est éteint, les résultats sont d&#39;abord présentés pour un compte d&#39;ajustement de courbe sur une échelle de 2-34 pm de diamètre (type M cassette) ou 2-26 μm (cassette de type S). Si mise à l&#39;échelle Automode est activé, le Z Moxi automatiquement l&#39;échelle de l&#39;axe horizontal (axe x) à la plage qui est plus proche de la largeur de la courbe de la population-forme tout en assurant toutes les données de courbe d&#39;ajustement est affichée. </li><li> Si l&#39;échelle AutoMode est éteint, pour afficher manuellement les résultats à une résolution plus élevée, touchez l&#39;icône 2-26 um (type M) ou sur l&#39;icône 2-18 um (Type S). Remarque: Le type de cassette est indiqué dans la boîte bleue en haut à gauche de l&#39;écran. Il est recommandé lors du comptage des cellules plus petites ou des particules d&#39;améliorer à la fois les capacités d&#39;ajustement de courbe ainsi que la capacité de l&#39;utilisateur visuellement discrimination nuances des données. </li><li> En augmentant la résolution horizontale, le bouton mise à l&#39;échelle d&#39;ajuster dynamiquement pour permettre à vélo entre les gammes disponibles échelle axe des x: 2-34, 2-26, 2-18 et 2-10 um pour la cassette de type M; ou 2 -26, 2-18, et 2-10 um pour la cassette du type S. Cette fonctionnalité est uniquement dispoble immédiatement après une numération cellulaire. </li><li> Compter informations (cellules par ml) pour la courbe d&#39;ajustement ou de la région fermée est affichée dans une zone noire sous le côté gauche de l&#39;histogramme. Moyenne taille de la cellule d&#39;information est affichée dans la boîte noire sous le côté droit de l&#39;histogramme. </li><li> La valeur MVI est affichée une boîte bleue en haut à droite de l&#39;histogramme. Si le test a été exécuté en mode petite particule, la MVI ne s&#39;applique pas et sera affiché comme «MVI = SPM». En outre, si la concentration de cellules est en dehors de la plage de fonctionnement MVI, un message de «MVI = Out of Range&quot; sera affiché. </li><li> Pour enregistrer l&#39;histogramme en cours, touchez l&#39;icône Terminé. Cela permet d&#39;économiser les données avec un nom de «Test XXX&quot; où XXX est le numéro de test correspondant. </li><li> Pour régler manuellement la porte de l&#39;histogramme, appuyez sur pour basculer l&#39;Fit Curve compte des résultats sur le bouton. Cela rend Gating le mode d&#39;acquisition par défaut. Ensuite, faites glisser chaque marqueur de déclenchement bleu pour définir les portes ou appuyez sur eflèches e gauche et droite (ceux-ci apparaissent en touchant le marqueur de porte bleu) d&#39;ajustement de grille fines seules les cellules entre les marqueurs sont comptés. L&#39;échelle verticale histogramme est automatiquement redimensionnée en fonction de l&#39;amplitude de la population courbe d&#39;ajustement. Pour régler cette échelle verticale, faites glisser l&#39;écran vers le haut ou vers le bas dans la région histogramme. </li><li> Touchez le comte Gated bouton résultats pour ramener l&#39;affichage en mode d&#39;ajustement de courbe et de faire en mode ajustement de la courbe du mode d&#39;acquisition par défaut. </li><li> Ensuite, appuyez sur l&#39;icône Terminé pour enregistrer les résultats et revenir à l&#39;écran d&#39;accueil. Pour supprimer les résultats, appuyez sur l&#39;icône supprimer à tout moment pour supprimer définitivement les résultats du test. </li></ol> 4. L&#39;analyse des données précédemment acquises <ol><li> Pour ouvrir un test enregistrés, appuyez sur l&#39;icône Histogramme sur l&#39;écran d&#39;accueil. </li><li> Icônes pour un maximum de neuf histogrammes enregistrées seront affichées sur l&#39;écran.Appuyez sur l&#39;icône appropriée pour le critère de l&#39;intérêt ou appuyez sur la Page Up et Page Down icônes pour afficher les résultats de tests plus. </li><li> Chaque histogramme sera ouvert dans le mode de comptage soit Curve Fit ou mode de comptage Gated, selon la façon dont il a été enregistré. En mode de comptage Gated, marqueurs de déclenchement peuvent être positionnés comme vous le souhaitez en faisant glisser chaque marqueur de déclenchement bleu indépendamment. Porte automatique en touchant sur ​​le sommet désiré. Touchez pour basculer entre le comte et les modes Gated ajustement de la courbe de comptage. </li><li> Appuyez sur les icônes de zoom et un zoom arrière pour régler l&#39;échelle verticale de l&#39;histogramme. L&#39;échelle verticale peut également être modifié par la verticale passant un doigt sur la place d&#39;affichage (pour augmenter) ou vers le bas (pour diminuer). </li><li> Appuyez sur l&#39;icône Supprimer pour supprimer définitivement les résultats du test. </li><li> Appuyez sur l&#39;icône Terminé pourfermer les résultats des tests et revenir à l&#39;écran d&#39;accueil. (Remarque: vue zoomée ne seront pas enregistrées.) </li></ol> 5. Transfert de données vers un PC <ol><li> Les données peuvent être transférées vers un PC en utilisant l&#39;application Moxichart Orflo ou via transfert USB en branchant le câble USB Moxi Z à un PC ou un Mac. Pour le transfert Bluetooth (MoxiChart), d&#39;abord déterminer ID Bluetooth de l&#39;appareil en appuyant sur ​​l&#39;icône Bluetooth sur l&#39;écran d&#39;accueil de l&#39;unité de Moxi Z. </li><li> Sur l&#39;ordinateur, ouvrez l&#39;application MoxiChart et cliquez sur l&#39;icône Bluetooth dans le coin supérieur droit. Puis, choisissez le périphérique qui correspond à l&#39;ID Bluetooth du Z Moxi et sélectionnez un dossier de destination pour les fichiers téléchargés. </li><li> Moxichart transférera automatiquement tous les fichiers dans le répertoire spécifié via la connexion Bluetooth. </li><li> Les fichiers transférés par Bluetooth (MoxiChart) ou USB peut être ouvert et d&#39;analysezed directement avec l&#39;application MoxiChart ou, parce qu&#39;ils sont formatés. csv, ils peuvent être ouverts directement dans Microsoft Excel ou d&#39;autres programmes d&#39;analyse de données pour l&#39;analyse de plus / custom. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Pour évaluer la précision et l&#39;exactitude des Z Moxi, les chiffres de HEK-293, les cellules HeLa, CHO-K1, la levure, Jurkat E6-1 des cellules, des cellules PC12, et de précision calibré suspensions de perles avec des concentrations allant de 0-500,000 cellules / mL (de type M cassette) et 0-2-2.5e 6 cellules / ml (cassette de type S) ont été comptées et comparées en utilisant un Coulter Z2 et le Z. Moxi Tous les cellules de mammifères ont été obtenus à partir de l&#39;American Type Culture Collection (ATCC) et cultivé comme décrit précédemment 7-11. Brièvement, les cellules ont été cultivées en suspension dans 75 mm 2 flacons de culture tissulaire avec les médias de base de RPMI 1640 (Jurkat E6-1, PC12), MEM (HEK-293, HeLa), ou F12K (CHO-K1) des cellules. Tous les médias a été complétée par10% de sérum de veau fœtal et 100 mg de streptomycine U penicillin/100. Flacons ont été maintenues dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2. Les cellules ont été repiquées tous les 3 jours. Les cellules de levure (X5, C. albicans, Vin 13) ont été donnés et l&#39;utiliser immédiatement comme prévu. Concentrations de l&#39;échantillon initial de ~ 500.000 cellules / ml pour les données de type M et les cassettes de ~ 2-2.5e 6 cellules / ml pour la cassette du type S ont été établies en utilisant le Z2 Coulter. Subséquents des niveaux de concentration théoriques ont été préparés par dilutions successives avec des tampons physiologiques (Isoton II ou une solution saline équilibrée de Hank). À chaque concentration, des échantillons identiques ont été mesurées par les deux systèmes et représentées les unes des autres. Comme on le voit dans la figure 2, il y avait une forte corrélation linéaire (de type M r 2&gt; 0,9886, Type S r 2&gt; 0,9781) entre les chiffres pour tous les échantillons. Les concentrations ont également été comparés à des concentrations cellulaires attendus / théorique à la fois avec le Z et le Moxi Z2 ( <strong&gt; Figure 3) et de nouveau fait preuve de fortes corrélations linéaires (de type M r 2&gt; 0,9758, Type S r 2&gt; 0.9774). Pour évaluer la précision, HEK-293 et ​​nombre de cellules HeLa ont été effectuées en utilisant le Z2 Coulter, Moxi Z, et un hémocytomètre. Le coefficient moyen de variation (CV, n = 19) des numérations cellulaires en utilisant le Z Moxi (Type M cassette), Coulter Z2 et un hémocytomètre ont été calculés avec CV est mesurée à partir de 5 chefs d&#39;accusation distincts dans les cellules 200.000-300.000 / Gamme ml. La petite moyenne CV (Figure 4) de la Z Moxi est comparable à celle de la Z2 et est représentatif du niveau élevé de précision ne peut être atteinte avec Coulter technologies basées sur de comptage. Dimensionnement de précision de l&#39;instrument Moxi Z a été évaluée par la mesure suivante de perles achetées de précision, de polystyrène calibrées. Moyennes des mesures de taille de particules (n = 5) de Moxi Z ont été tracées selon des tailles de fabricant signalés. Comme on le voit in Figure 5, les mesures Moxi Z s&#39;accompagnent pas les valeurs du fabricant avec une forte corrélation linéaire (r 2 = 0,9989). Au-delà de la taille et les informations de comptage, Moxi Z fournit un réactif-libre, l&#39;évaluation générale de la santé de culture cellulaire de mammifère avec un indice de viabilité Moxi rapporté (MVI) de valeur. Cet indice est généré à partir d&#39;un rapport entre le nombre de cellules dans la population d&#39;intérêt par rapport aux chiffres de particules totales. Pour démontrer les capacités de mesure MVI, lectures MVI (Type M cassette) ont été comparés au manuel standard et de cytométrie en flux techniques de mesure en direct / mort. Les populations de morts (&lt;10% de viabilité) HEK-293 et ​​les cellules HeLa ont été créées par des incubations nuit des cellules vivantes dans un fluorure de nutriments sans sodium, contenant un diluant (Isoton II, Beckman Coulter) à 37 ° C. Contrôlés les niveaux de viabilité théoriques ont été préparés par mélange ratiometrically des concentrations connues de cellules vivantes et mortes. Ressolutions ulting ont été analysés pour les niveaux de viabilité, en double exemplaire avec les chiffres et les mesures hémocytomètre deux cytomètre en flux. Mesures ont été faites hémocytomètre en utilisant une traditionnelle mélange 50/50 de 0,1% Solution bleu trypan et les cellules. Mesures de cytométrie de flux ont été faites en utilisant un cytomètre Goyave PCA (Merck) en utilisant le réactif Viacount et le fabricant spécifié par le protocole (Merck). Comme le montre la figure 6, les valeurs de coefficient de corrélation de Pearson (r 2) &quot;de l&#39;ajustement linéaire des données à MVI analogues pourcentages de viabilité hémocytomètre pour&quot; cellules HEK et cellules HeLa ont été r 2 = 0,9937 et r 2 = 0,9728, respectivement. Ces résultats démontrent que cette approche fournit des informations de santé de la culture dans une large gamme de viabilités cellulaires qui se comparent favorablement aux mesures Live / Dead obtenus en utilisant un cytomètre en flux ou hémocytomètre. Tableaux et figures (De Dittami et al, 2011.) 15: Figure 1. Thin-film de comptage Coulter: Le courant électrique est passé à travers la zone de cellule de détection de la cassette à film mince. Comme les cellules circuler seul fichier par l&#39;intermédiaire du CSZ, les augmentations momentanées de tension sont mesurés par le Z. Moxi <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig2.jpg" /> Figure 2. Moxi chiffres Z sont comparables à Coulter Z2 chiffres. Chiffres identiques de suspensions cellulaires et de talon ont été comptées en utilisant à la fois un Z2 Coulter et l&#39;Z. Moxi Averaged valeurs de comptage (n = 3-4) des chiffres Z Moxi ont été tracées par rapport à la Coulter Z2 correspondant comtes et des valeurs r 2 de l&#39;ajustement linéaire ont été déterminés. A) de type M cassette - gamme de concentration de 0 - 500.000 cellules par ml. B) la cassette de type S - gamme de concentration de 0 - 2-2.5e 6 / Bars ml.Error indiquent ± 1 écart-type. Figure 3. Mesures de concentration Moxi Z vs concentrations cellulaires théoriques. A) de type M cassette - des valeurs de concentration théoriques ont été préparés à partir de dilutions en série d&#39;un 500.000 initiales cellules par ml d&#39;échantillon B) de cassettes de type S -. Valeurs de concentration théoriques ont été préparés à partir de dilutions en série d&#39;une initiale 2 - 2.5e 6 cellules / ml d&#39;échantillon. Barres d&#39;erreur indiquent ± écart-type 1. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig4.jpg" /> Figure 4. Coefficient de variation pour le Z2 Coulter, Moxi Z (Type M cassette), et hémocytomètre. Le coefficient moyen de variation (CV, n = 19) de cellules HEK-293 et nombre de cellules HeLa pour chaque approche ont été calculés avec CV mesurées à partir de 5 séparés chefs d&#39;accusation de HEK-293 et ​​les cellules HeLa dans le 200.000 - 300.000 cellules par ml. gamme Barres d&#39;erreur indiquent ± écart-type 1. Figure 5. Précision des mesures de taille de particules en utilisant Moxi Z-Z Moxi mesurée taille des billes (Type M cassette) vs fabricant indique la taille du cordon. Barres d&#39;erreur indiquent ± écart-type 1. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/3842/3842fig6.jpg" /> Figure 6. Évaluation de la santé de la culture à l&#39;aide MVI - Comparaison des mesures de MVI (Type M cassette) et Goyave PCA Viacount viabilité par rapport visuels, trypan bleu compte de la viabilité colorées à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre.

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Gregory M. Dittami et SE Ayliffe sont des employés de Technologies Orflo, la société qui a conçu, fabrique et vend le Moxi Z. Richard D. Rabbitt fournit à temps partiel, de l&#39;expertise de conseil versés aux technologies de l&#39;Orflo. La production et l&#39;accès gratuit à cet article est sponsorisé par Technologies Orflo.

La mise en œuvre de l&#39;approche sous-jacente Coulter peut être très déterministe de la précision globale des mesures. Une zone critique est la correction des numérations cellulaires premières pour «coïncidence» des événements où deux ou plusieurs cellules en même temps passer à travers l&#39;ouverture et sont évalués comme un seul événement électrique. «Les événements de coïncidence&quot; contribuer à l&#39;erreur qui varie en fonction d&#39;un certain nombre de facteurs, y compris la taille des cellules et le degré de regroupement (Davis et al 1967) 6. En conséquence, la correction de coïncidence requise pour un échantillon donné ne peut être prédit, variant considérablement entre les cellules / particules types et même entre les différentes cultures de types de cellules identiques. Créée théorie, ancrée dans les publications initiales par Coulter, consiste à appliquer un ajustement logarithmique des données brutes sur la base du nombre d&#39;événements observés et empiriquement déterminée, le facteur de correction de particules spécifique, z. Bien que des chiffres exacts peuvent être correctement réalisé avec tson algorithme de correction, il est limité dans son application pratique en raison des grandes variations de valeurs de z entre les types de cellules et de la difficulté de prévoir avec exactitude correspondant à sa valeur. Ici, en utilisant le nombre &quot;vrai&quot; cellule identifiée par le raccord Moxi courbe Z en conjonction avec l&#39;algorithme de correction de coïncidence, le Z Moxi corrige de façon dynamique pour une coïncidence pour obtenir les concentrations réelles. Lorsque comparés aux résultats obtenus à l&#39;aide de haut de gamme Coulter Z2, Z Moxi produit compte comparables à travers une gamme de concentration de 0 à 500.000 cellules / ml (de type M cassette) et 3000 - 2-2.5e 6 cellules / ml (cassette de type S) . En outre, le Z Moxi atteint cette précision de comptage avec un coefficient similaire faible variation dans le nombre et la précision dans granulométrie qui est caractéristique de l&#39;étalon-or, Coulter-technique dans le comptage des cellules. En outre, les données présentées ici indiquent que le Z Moxi peut fournir de précieuses informationsen ce qui concerne la santé globale des cultures cellulaires. Le Z Moxi s&#39;appuie sur l&#39;approche d&#39;ajustement de courbe avec un algorithme de logiciel propriétaire pour déterminer ce bilan de santé de la culture. Les modifications morphologiques associées à la mort cellulaire, tels que blebbing, se décomposer, et les distorsions volumétriques (Kataoka et Tsuruo 1996, Liegler et al 1995, Sheridan et al 1981) 12-14, permettent à l&#39;Moxi-Z à distinguer les différences entre les impédimétriques vivent les populations et les morts cellulaires / débris des populations. Le MVI est généré par l&#39;analyse de la distribution de la taille de la culture / particules pour identifier les contributions relatives des débris de particules, rétrécis cellules nécrotiques, et la courbe ajustée-population de cellules d&#39;intérêt. La valeur MVI reflète donc un indice de population ou d&#39;une mesure ratiométrique des chiffres de population monodisperses en ce qui concerne le profil de la population globale des particules. Cette valeur est alors algorithmiquement-ajustées des statistiques basées sur la population et des observations empiriques. Because de la MVI regarde d&#39;autres paramètres que les approches traditionnelles de coloration, on ne s&#39;attend pas à refléter ces techniques, mais fournit plutôt un autre point de vue précieux sur la santé d&#39;une culture cellulaire, en particulier en ce qui concerne les débris et les contaminants microbiens. En résumé, le compteur de cellules Moxi-Z est un instrument de paillasse ultra léger qui fournit des analyses précises, reproductibles de comptage des cellules, la taille des cellules, et la santé des cellules en utilisant le principe de Coulter et des algorithmes logiciels d&#39;ajustement de courbe combinée avec une technologie de capteur à couche mince brevetée . Avec la cassette de type M, il est capable de compter des particules allant de 4 à 25 microns de diamètre (plage dynamique de 2 - 34 microns), en 8 secondes. Avec cassette du type S, il est capable de compter des particules allant de 3 à 20 microns de diamètre (plage dynamique de 2 - 26 microns), en 15 secondes. En outre, le Moxi-Z effectue des évaluations de santé, sans l&#39;utilisation de réactifs. C&#39;est intégration du travail beaucoup moinsnsive et subjective que le comptage manuel. En comparaison à la norme Coulter comptage, le Moxi est plus rapide, beaucoup plus petite, fournit de plus amples renseignements, nécessite un entretien beaucoup moins, c&#39;est plus facile à utiliser, et est une fraction du coût.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> ORFLO diluant </td><td> ORFLO </td><td> MXA006 </td><td></td></tr><tr><td> Distributeur Cassette </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Stocke jusqu&#39;à 25 cassettes pour pratique de distribution </td></tr><tr><td> Câble USB </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Connecte instrument pour PC / Mac ou d&#39;un adaptateur </td></tr><tr><td> Adaptateur secteur (modèles américains et européens seulement) </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Connecte le câble USB à une prise secteur </td></tr><tr><td> USB Flash Drive </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Magasins Moxi le logiciel Z et mode d&#39;emploi </td></tr><tr><td> Perles Vérifier l&#39;étalonnage </td><td> ORFLO </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cassette d&#39;étalonnage électronique </td><td> ORFLO </td><td></td><td> Cassette électronique pour vérifier le fonctionnement correct du système et d&#39;étalonnage </td></tr></tbody></table>

determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the moxi z mini automated cell counter

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques6.
Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for "coincidence events" in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.
The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 - 25 microns (dynamic range 2 - 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 - 20 microns (dynamic range 2 - 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 - 8,180 fL and the 3 - 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 - 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a "Cell Sensing Zone" (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.
Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.

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Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Le Moxi Z miniature compteur de cellules automatisé est un nouvel instrument qui combine le principe Coulter avec la technologie brevetée du capteur à couche mince et d&#39;un algorithme logiciel propriétaire pour effectuer le calibrage et le comptage d&#39;une gamme de taille large de particules ainsi que pour déterminer la santé globale de monodisperse cultures de cellules de mammifères. Ce protocole décrit l&#39;utilisation de cet instrument pour le comptage et l&#39;évaluation de la santé des cultures cellulaires.

Détermination du nombre de cellules de mammifères, taille des cellules et la santé des cellules à l&#39;aide du Moxi Mini Z Compteur de cellules automatisé

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

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Research

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Biology

24.5K vues.  Orflo Technologies. Le Moxi Z miniature compteur de cellules automatisé est un nouvel instrument qui combine le principe Coulter avec la technologie brevetée du capteur à couche mince et d'un algorithme logiciel propriétaire pour effectuer le calibrage et le comptage d'une gamme de taille large de particules ainsi que pour déterminer la santé globale de monodisperse cultures de cellules de mammifères. Ce protocole décrit l'utilisation de cet instrument pour le comptage et...

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Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Cellules d&#39;imagerie à long terme des mammifères en utilisant la microscopie à champ large

Recherche

Biologie

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Pulse-chase Analyse des chaînes de sucre N-glycoprotéines liées à des cellules de mammifères

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Aide d&#39;un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d&#39;expression génique: Knockdown siRNA de l&#39;IL-4 dans l&#39;expression des gènes dépendant cellules Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

EsiRNA MISSION pour le dépistage de l&#39;ARNi dans les cellules de mammifères

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and accuracy. Cell counts are important for monitoring cell health and proliferation rate, assessing immortalization or transformation, seeding cells for subsequent experiments, transfection or infection, and preparing for cell-based assays. It is important that cell counts be accurate, consistent, and fast, particularly for quantitative measurements of cellular responses.
Despite this need for speed and accuracy in cell counting, 71% of 400 researchers surveyed1 who count cells using a hemocytometer. While hemocytometry is inexpensive, it is laborious and subject to user bias and misuse, which results in inaccurate counts. Hemocytometers are made of special optical glass on which cell suspensions are loaded in specified volumes and counted under a microscope. Sources of errors in hemocytometry include: uneven cell distribution in the sample, too many or too few cells in the sample, subjective decisions as to whether a given cell falls within the defined counting area, contamination of the hemocytometer, user-to-user variation, and variation of hemocytometer filling rate2.
To alleviate the tedium associated with manual counting, 29% of researchers count cells using automated cell counting devices; these include vision-based counters, systems that detect cells using the Coulter principle, or flow cytometry1. For most researchers, the main barrier to using an automated system is the price associated with these large benchtop instruments1.
The Scepter cell counter is an automated handheld device that offers the automation and accuracy of Coulter counting at a relatively low cost. The system employs the Coulter principle of impedance-based particle detection3 in a miniaturized format using a combination of analog and digital hardware for sensing, signal processing, data storage, and graphical display. The disposable tip is engineered with a microfabricated, cell- sensing zone that enables discrimination by cell size and cell volume at sub-micron and sub-picoliter resolution. Enhanced with precision liquid-handling channels and electronics, the Scepter cell counter reports cell population statistics graphically displayed as a histogram.

The Scepter Cell Counter is a handheld automated device that can be used to count cells, monitor cell diameter and volume, and be used to check the health and quality of cellular populations from one culture to the next.

Déterminer le nombre de cellules pendant la culture cellulaire en utilisant le compteur cellulaire Sceptre

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse de la situation du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the calcium-binding protein known as calmodulin (CaM)1,2. CaM is involved at multiple levels in almost all cellular processes, including apoptosis, metabolism, smooth muscle contraction, synaptic plasticity, nerve growth, inflammation and the immune response. A number of proteins help regulate these pathways through their interaction with CaM. Many of these interactions depend on the conformation of CaM, which is distinctly different when bound to Ca2+ (Ca2+-CaM) as opposed to its Ca2+-free state (ApoCaM)3.
While most target proteins bind Ca2+-CaM, certain proteins only bind to ApoCaM. Some bind CaM through their IQ-domain, including neuromodulin4, neurogranin (Ng)5, and certain myosins6. These proteins have been shown to play important roles in presynaptic function7, postsynaptic function8, and muscle contraction9, respectively. Their ability to bind and release CaM in the absence or presence of Ca2+ is pivotal in their function. In contrast, many proteins only bind Ca2+-CaM and require this binding for their activation. Examples include myosin light chain kinase10, Ca2+/CaM-dependent kinases (CaMKs)11 and phosphatases (e.g. calcineurin)12, and spectrin kinase13, which have a variety of direct and downstream effects14.
The effects of these proteins on cellular function are often dependent on their ability to bind to CaM in a Ca2+-dependent manner. For example, we tested the relevance of Ng-CaM binding in synaptic function and how different mutations affect this binding. We generated a GFP-tagged Ng construct with specific mutations in the IQ-domain that would change the ability of Ng to bind CaM in a Ca2+-dependent manner. The study of these different mutations gave us great insight into important processes involved in synaptic function8,15. However, in such studies, it is essential to demonstrate that the mutated proteins have the expected altered binding to CaM.
Here, we present a method for testing the ability of proteins to bind to CaM in the presence or absence of Ca2+, using CaMKII and Ng as examples. This method is a form of affinity chromatography referred to as a CaM pull-down assay. It uses CaM-Sepharose beads to test proteins that bind to CaM and the influence of Ca2+ on this binding. It is considerably more time efficient and requires less protein relative to column chromatography and other assays. Altogether, this provides a valuable tool to explore Ca2+/CaM signaling and proteins that interact with CaM.

Calmodulin (CaM) pull-down assay is an effective way to investigate the interaction of CaM with various proteins. This method uses CaM-sepharose beads for efficient and specific analysis of CaM-binding proteins. This provides an important tool to explore CaM signaling in cellular function.

Pull-down des protéines se liant à la calmoduline

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Mesure des niveaux Heme synthèse dans des cellules de mammifères

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized plasmids for expression of exogenous genes in mouse embryonic stem cells (mESCs). Expression of exogenous genes under the control of the SV40 or human cytomegalovirus promoters diminishes quickly after transfection into mESCs. A remedy for this diminished expression is to use the human elongation factor-1 alpha (hEF1&#945;) promoter to drive gene expression. Plasmid vectors containing hEF1&#945; are not as widely available as SV40- or CMV-containing plasmids, especially those also containing N-terminal 3xFLAG-tags. The protocol described here is a rapid method to create plasmids expressing FLAG-tagged CstF-64 and CstF-64 mutant under the expressional regulation of the hEF1&#945; promoter. GA uses a blend of DNA exonuclease, DNA polymerase and DNA ligase to make cloning of overlapping ends of DNA fragments possible. Based on the template DNAs we had available, we designed our constructs to be assembled into a single sequence. Our design used four DNA fragments: pcDNA 3.1 vector backbone, hEF1&#945; promoter part 1, hEF1&#945; promoter part 2 (which contained 3xFLAG-tag purchased as a double-stranded synthetic DNA fragment), and either CstF-64 or specific CstF-64 mutant. The sequences of these fragments were uploaded to a primer generation tool to design appropriate PCR primers for generating the DNA fragments. After PCR, DNA fragments were mixed with the vector containing the selective marker and the GA cloning reaction was assembled. Plasmids from individual transformed bacterial colonies were isolated. Initial screen of the plasmids was done by restriction digestion, followed by sequencing. In conclusion, GA allowed us to create customized plasmids for gene expression in 5 days, including construct screens and verification.

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&amp;#945; Promoter Using Gibson Assembly

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

Génération de vecteurs plasmidiques exprimant des protéines de marquage Flag En vertu du règlement de l&#39;allongement Human Factor-1α promoteur Utilisation Assemblée Gibson

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Protein livraison directe aux cellules de mammifères en utilisant la cellule perméable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Domaines doigt de zinc

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...