Les sphéroïdes des cellules cancéreuses du sein décrits ici permettront aux chercheurs d’étudier les mécanismes moléculaires des interactions des cellules endothéliales des cellules cancéreuses qui sont impliquées dans la prolifération et les métastases des cellules cancéreuses. Le principal avantage de ce modèle 3D est qu’il fournit un arrangement cellulaire plus réaliste qui améliore la fiabilité des inférences concernant la physiopathologie et le traitement du cancer du sein. Giovanna Azzarito, doctorante de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.
Commencez par traiter ou transfecter les cellules plaquées pendant 24 heures, ou comme vous le souhaitez. Pour identifier la distribution cellulaire dans le sphéroïde, lavez les cellules avec un millilitre de solution saline équilibrée de Hanks ou HBSS, contenant du calcium et du magnésium et restez dans des HUVEC en utilisant 0,5 microgramme par millilitre de colorant bleu. Et les cellules MCF-7 utilisant un colorant vert 0,5 micromolaire dilué dans le respect du milieu de croissance.
Placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de CO2 pendant 30 à 40 minutes. Lavez les cellules avec un millilitre de HBSS sans calcium ni magnésium. Ajoutez ensuite un millilitre de réactif de détachement enzymatique, soit 0,25% de trypsine pour HUVEC et 0,5% de voyages dans quatre MCF-7 à chaque plat brun à l’aide d’une pipette P1000.
Choisissez chaque type de cellule séparément dans un tube de polystyrène à fond rond de cinq millilitres et ajoutez un millilitre de sérum de veau fœtal à 10 % ou de milieu FCS à l’aide d’une pipette P1000 pour arrêter la réaction enzymatique. Ensuite, centrifugez les suspensions de cellules à 250 fois G pendant cinq minutes. Aspirez soigneusement le surnageant et suspendez les cellules dans un millilitre de milieu sans stéroïdes.
Utilisez 100 microlitres de chaque suspension cellulaire diluée avec 10 millilitres de diluant 2 pour déterminer le nombre total de cellules. Allumez la machine et rincez en appuyant sur les boutons de fonction et de démarrage, avec la solution de Diluent 2 dans un flacon de compteur de cellules. Utilisez la mise en place à quatre et appuyez sur start pour mesurer l’ébauche avec une solution fraîche de Diluent 2.
Changer le flacon de scintillation avec 100 microlitres de suspension cellulaire dans 10 millilitres de solution de diluant 2. Utilisez la configuration à quatre et appuyez sur Démarrer pour mesurer les échantillons. Notez le nombre de cellules par millilitre sur l’écran numérique, puis préparez cinq millilitres de chaque suspension cellulaire et mélangez-les pour obtenir un volume final de 10 millilitres dans un rapport de un à un, en utilisant une pipette répétitive manuelle pour pipeter 100 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque inférieure en U de 96 puits.
Placez la plaque dans un incubateur dans des conditions de culture tissulaire standard et vérifiez la présence d’une formation de sphéroïdes après 48 heures. Prenez des photos de ces sphéroïdes à un grossissement de 40 X à l’aide d’un stéréomicroscope à contraste de phase ou à fluorescence. Pour préparer la culture de goutte suspendue, mélangez les suspensions cellulaires dans un rapport de un pour un pour obtenir un volume final de deux millilitres.
Utilisez une pipette P20 pour voir le mélange cellulaire sous la forme de gouttes de 15 microlitres sur le plomb inversé d’une boîte de Petri de 10 centimètres. Inverser le couvercle avec les gouttes et ajouter cinq millilitres de milieu de base EBM-2 au fond du plat pour éviter l’évaporation des gouttes. Recueillir environ 50 sphéroïdes dans un tube de 1,5 millilitre avec une pointe d’intestin d’une pipette de microlitre P200.
Laissez-les se déposer au fond du tube par gravité, puis jetez le surnageant. Fixez ces sphéroïdes avec 500 microlitres de 4% PFA pendant une heure à température ambiante. Faire bouillir 2% Nobel Algor Solution dans PBS à l’aide d’une plaque chauffante avec un brassage magnétique pendant trois à cinq minutes pour dissoudre complètement la poudre augureuse et refroidir à environ 60 degrés Celsius.
Retirez le PFA avec une pipette P1000, lavez ces sphéroïdes avec 500 microlitres de PBS et laissez-les sédimenter. Une fois installé, jetez soigneusement le surnageant pipette 600 microlitres de solution Agora dans le tube de 1,5 millilitre avec des sphéroïdes et placez le tube immédiatement dans une centrifugeuse avec un rotor horizontal à 177 fois G pendant deux minutes. Ajoutez une courte ficelle au milieu de l’Agro Solution pour retirer facilement le bouchon du tube.
Solidifiez le bouchon Agros sur de la glace ou, à quatre degrés Celsius, ajoutez 500 microlitres de PBS dans le tube de 1,5 millilitre pour éviter de dessécher la pastille. Acquérir des images de sections sphéroïdes à l’aide d’un stéréomicroscope. Calculer la quantité de solution nécessaire pour ajouter 10 microlitres par puits d’un mélange d’Aam de calcium et d’homodimères d’éthidium dilués à l’aide d’EBM-2 dans un rapport de un à 50.
Ajouter le mélange colorant aux sphéroïdes et placer la plaque dans l’incubateur sous la norme, les conditions de culture tissulaire pendant 30 à 60 minutes. Obtenez des images à un grossissement de 40 X à l’aide du stéréomicroscope à fluorescence. Dans les plaques à fond en U, la formation de sphéroïdes a été observée 48 heures après l’ensemencement de sept cellules MCF.
Cependant, la formation de sphéroïdes n’a pas été observée dans le cas des cellules endothéliales ou lymphatiques. L’ensemencement des cellules endothéliales MCF sept plus ou MCF sept cellules lymphatiques plus à un rapport de un pour un a également entraîné la formation de sphéroïdes. Une croissance séquentielle dépendante du temps de MCF sept sphéroïdes a été enregistrée allant de 24 à 120 heures.
La taille des sphéroïdes est passée d’environ 100 micromètres à environ 200 micromètres en cinq jours. Avec un taux de croissance accru observé dans les sphéroïdes traités avec le stimulateur de croissance. La structure des sphéroïdes et la forme de leurs cellules n’ont montré aucune anomalie après transfection avec des oligonucléotides de contrôle en présence de lipofectamine.
Les cellules exprimant leur marqueur prolifératif Ki-67 ont été distribuées de manière homogène dans ces sphéroïdes. Clivage à la caspase trois colorations de ces sphéroïdes ont montré des cellules apathiques après quatre jours de culture. L’étude des cellules de ces sphéroïdes avec CD-31 et Ki-67 a révélé que 55% des cellules sont épithéliales, 45% sont endothéliales et 25% des cellules prolifèrent.
Pour évaluer le pourcentage de cellules vivantes et mortes, des sphéroïdes âgés de quatre jours ont été colorés avec de l’Aam de calcium et de l’homodimère d’éthidium. Un sphéroïde fraîchement pensé également teinté pour les cellules mortes et vivantes a révélé que les sphéroïdes sont très sensibles aux conditions de congélation. Lorsque vous suivez son protocole, assurez-vous que des cellules saines sont utilisées pour mélanger l’aphrodite Une autre chose à retenir serait d’éviter d’endommager ces aphrodites pendant le capuchon DP pour obtenir une bonne section assurant également au palais l’aphrodite avant que l’ensemble ne polymérise.
Ce modèle pourrait être encore amélioré en incluant d’autres cellules, telles que les fibroblastes impliqués dans la progression tumorale et en l’utilisant pour évaluer l’efficacité des agents thérapeutiques ciblant une croissance cancéreuse.
