Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH DE018304, R01DE018281. KT est soutenu par T32 GM07092-34 et par une subvention à l&#39;Université de Caroline du Nord à Chapel Hill de Howard Hughes Medical Institute (HHMI) à travers la Méditerranée en Grad Initiative. PC T32 est soutenu par CA009156.

Les tableaux qPCR profilage pré-miARN peuvent être mis en place comme entièrement automatisée avec un robot Tecan Freedom EVO (A) ou à la main avec la pipette multicanaux matrice électronique (B). 1) Préparer le mélange maître, plaques apprêt et échantillons. <ol><li> Plaques amorce contenant 186 paires d&#39;amorces au format 96 puits (un total de 2 plaques) à 12h05 doit être stocké à -80 ° C. Plaques décongeler à température ambiante, vortex et centrifuger brièvement avant utilisation. </li><li> Pour préparer le mélange maître, dégeler SYBR Green PCR 2x Mélanger à température ambiante. Chaque réaction utilise master mix 8ul avec un apprêt 2UL. La composition du mélange maître par réaction est un mélange SYBR 4UL, l&#39;eau de qualité 3UL PCR et 10-20 ng d&#39;échantillon d&#39;ADN ou d&#39;ADNc. </li><li> Pour la configuration de chaque plaque d&#39;amorce de 96 puits, quatre tubes master mix sera nécessaire. Les échantillons peuvent être exécutés 4 échantillons par plaque (singlicate), 2 échantillons par plaque (double) ou d&#39;un seul échantillon en quatre exemplaires. </li><li> Préparer le mélange maître en combinant SYBR, l&#39;eau et l&#39;échantillon dans chacun des tubes Eppendorf 4-2ml. Chaque tube doit contenir master mix assez pour environ 100 réactions, permettant l&#39;excès pour le pipetage des déchets. Vortex pour mélanger. </li></ol> Configuration A. de dosage pré-miARN utilisant la Liberté Tecan Evo robot. <ol><li> Après l&#39;initialisation du robot et le chargement du programme EVOware, rincer trois fois avec chaque 30ml pour effacer le système de bulles d&#39;air qui va interférer avec la précision de pipetage. </li><li> Configuration de la plateforme de robot pour y inclure les éléments suivants: <ul><li> Étiqueté 384 puits </li><li> Plaque de 96 puits d&#39;amorces (1) </li><li> Maître mêle </li><li> Un bac contenant de l&#39;eau de Javel à 2% </li><li> Un récipient rempli de liquide du système </li><li> Conteneur à déchets vide </li></ul></li><li> Commencez courir robot automatisé en sélectionnant &quot;Exécuter&quot; deux fois. </li><li> À la fin du programme, retirez la plaque de 384 puits et sceller avec une feuille d&#39;étanchéité LightCycler 480 et centrifuger brièvement. Placez scellées plaque de 384 puits dans la position 1 de l&#39;hôtel. </li><li> Passez à l&#39;étape 2.2 et répéter pour 2 plaque d&#39;amorce avec des mélanges nouveau maître et une nouvelle plaque de 384 puits. <ol><li> Placer la plaque scellée en position 2 de l&#39;hôtel. </li></ol></li><li> Ouvrez nouveau programme EVOware pour le chargement des Lightcycler de l&#39;hôtel et sélectionner &quot;Exécuter&quot; deux fois. <ol><li> Freedom EVO se charge automatiquement chaque plaque dans le LightCycler et exécutez la commande suivante SYBR-vert I / GRH programme de cyclisme: Pré (1 cycle): 50 ° pendant 5 minutes à vitesse de rampe de 4,8 ° / sec 95 ° pendant 5 minutes à vitesse de rampe de 4,8 ° / sec Amp (45 cycles): 95 ° pendant 15 secondes au taux de rampe de 4,8 ° / sec 62 ° pendant 30 sec à vitesse de rampe de 2,5 ° / sec (Simple d&#39;acquisition de données au cours de cette étape) Courbe de fusion: 95 ° pendant 5 sec à vitesse de rampe de 4,8 ° / sec 60 ° pendant 1 minute à taux de rampe de 2,5 ° / sec 95 ° en continu au taux de rampe de 0,11 ° / sec avec 5 acquisitions par ° C Cool: 50 ° pendant 30 sec à vitesse de rampe de 25 ° / sec </li></ol></li></ol> Installation de dosage B. miARN pré-utilisation de la pipette multicanaux matrice électronique: <ol><li> Placez le contenu du tube master mix 1 dans un réservoir. </li><li> Régler la pipette pour aspirer électroniques 16ul de mélange maître avec 2-8ul passer les étapes suivies par une étape de purge. </li><li> Pour Mix Master 1, passer dans chaque 8ul bien d&#39;autres de la plaque de 384 puits (réglé sur 384 et l&#39;espacement pointe), en commençant par le puits A1. (Ie puits A1, C1, E1, etc) Pour la seconde 8ul passer, passer à la colonne 3 (ie puits A3, C3, E3, etc) puis purger au cours d&#39;un conteneur de déchets et des conseils céder. </li><li> Suivez ce modèle pour les 5 autres cycles jusqu&#39;à atteindre ainsi A23. </li><li> Répétez l&#39;opération pour Mix Master 2, (à commencer par godet A2, C2, E2, etc); master mix 3 (à partir de puits B1, D1, F1, etc); master mix 4 (à partir de B2, D2, F2, etc .). </li><li> Pour aliquotting de plaque d&#39;amorce, mettre une pipette pour aspirer 2UL électroniques et dispenser 2UL avec une étape de purge suivante. Distribuer 2UL d&#39;amorces de la colonne 1 de la plaque de 96 puits d&#39;amorces (AH) dans la plaque de 384 puits, puits A1, C1, E1, etc purge sur un conteneur à déchets et des conseils céder. Répétez l&#39;opération pour puits A2, C2, E2, B1, D1, F1, et B2, D2, F2, etc </li><li> Répétez l&#39;opération pour les lignes 2-12 du amorces de 96 puits, se déplaçant sur tous les 2 colonnes pour chaque colonne d&#39;apprêt, jusqu&#39;à plein 384 puits ont été aliquotes. </li><li> Sceau plaques avec un film d&#39;étanchéité LightCycler et centrifuger brièvement. </li><li> Plaques Placer dans un LightCycler 480 et le cycle des plaques en fonction des paramètres suivants en utilisant le SYBR Green I / format de détection de la GRH: Pré (1 cycle): 50 ° pendant 5 minutes à vitesse de rampe de 4,8 ° / sec 95 ° pendant 5 minutes à vitesse de rampe de 4,8 ° / sec Amp (45 cycles): 95 ° pendant 15 secondes au taux de rampede 4,8 ° / sec 62 ° pendant 30 sec à vitesse de rampe de 2,5 ° / sec (Simple d&#39;acquisition de données au cours de cette étape) Courbe de fusion: 95 ° pendant 5 sec à vitesse de rampe de 4,8 ° / sec 60 ° pendant 1 minute à taux de rampe de 2,5 ° / sec 95 ° en continu au taux de rampe de 0,11 ° / sec avec 5 acquisitions par ° C Cool: 50 ° pendant 30 sec à vitesse de rampe de 25 ° / sec </li><li> Répétez l&#39;aide de 2 plaque d&#39;amorce, aliquotting dans une plaque fraîche de 384 puits en utilisant des mélanges maîtres fraîchement préparés. </li></ol> Secrets de la réussite: Une caractéristique importante lors de la conception des tableaux de PCR est que tous les 186 paires d&#39;amorces ont la même température de recuit, donc la plaque peut être exécuté avec les mêmes paramètres de PCR optimales programme exécuté. Chaque nouveau tableau doit être vérifiée en utilisant trois contrôles avant les échantillons. Ces contrôles sont: 1 piste de toutes les amorces fonctionner avec de l&#39;eau ou 0,1 x TE d&#39;exclure la contamination primaire. 1 piste de l&#39;alternance eau / TE et de contrôle positif, afin de s&#39;assurer qu&#39;aucun report. 3 pistes en utilisant le même contrôle positif, afin d&#39;assurer la reproductibilité entre les courses. Master Mix doit être fraîchement préparée, et les plaques doivent être exécutés dans les 24 heures pour des résultats optimaux Feuille plaque d&#39;amorce doit être retiré lentement pour réduire le risque de contamination entre les puits. Lors de l&#39;utilisation d&#39;un robot avec des conseils fixes, laver l&#39;eau de Javel à 2% est nécessaire de laver les bouts entre chaque étape de pipetage, suivie d&#39;un rinçage à l&#39;eau. Cela évite et élimine le report, ce qui pourrait contaminer les autres données et conduire à des résultats concluants. Après une plaque est géré par le LightCycler, il ne devrait pas être ouverte à nouveau dans la salle de configuration PCR. Cela permet d&#39;éviter la contamination PCR. Les résultats représentatifs: résultats de qPCR sont généralement représentés par des valeurs de CT tel que déterminé par le logiciel d&#39;analyse LightCycler. Une course réussie se compose généralement d&#39;une gamme de TC pour les échantillons, généralement entre 20 à 35 pour les échantillons qui sont positifs. Les échantillons d&#39;eau dans une bonne course sont toujours à un CT&gt; 40 et tous les échantillons ou de puits spécifique avec un CT de plus de 37 sont considérés comme négatifs ou non détecté. En règle générale, les échantillons donnant une CT de &lt;10 sont également peu fiables et sont exclus de l&#39;analyse. Il ya plusieurs façons d&#39;analyser les données qPCR et l&#39;inclusion de contrôles internes dans notre test permet de contrôler les variations de l&#39;entrée de l&#39;échantillon. Le tableau pré-miR comprend un apprêt de contrôle U6, qui est souvent utilisé comme un gène de référence pour normaliser les valeurs CT à partir d&#39;échantillons différents. Cette valeur normalisée est appelée la valeur delta CT (DCT). Les résultats sont souvent représentées comme le CT premières, la valeur DCT ou peut encore être analysés pour des valeurs normalisées. Dans la figure 1, l&#39;analyse de la pleine pré-microARN tableau de quatre échantillons différents d&#39;une expérience timecourse est présenté en format carte de chaleur. L&#39;expression relative de chaque pré-microARN est montré et trois majeurs, les clusters distincts ont émergé. La majorité des pré-mirs analysé subi de petites modifications insignifiantes comme prévu (figure 1A). Cependant, une petite portion de pré-microARN ont été significativement diminué (figure 1B) ou augmenté de façon spectaculaire (figure 1C) à travers l&#39;expérience timecourse. Les niveaux d&#39;expression de chacun de pré-microARN ont été normalisées à l&#39;timepoint 0h (échantillon 1) comme un niveau de référence. Dans certains cas, vous pouvez noter que certains des clusters pré-microARN également se regrouper dans l&#39;analyse heatmap (ex: laissez-7a Figure 1B,). Selon l&#39;expérience, les clusters peuvent émerger qui dépendent de l&#39;infection virale, l&#39;expression type de cellule spécifique de pré-microARN ou pré-mirs qui sont réglementés par une molécule commune ou la voie de signalisation. Le test pré-microARN que nous avons développé comprend également un certain nombre de pré-viraux connus microARN codés par des gènes et le sarcome de Kaposi herpèsvirus associé (KSHV) et le virus Epstein Barr (EBV), en plus de l&#39;homme pré-mirs. Ceux-ci peuvent être utilisés comme contrôles positifs ou négatifs, selon la lignée cellulaire et statut viral des échantillons utilisés. Dans la figure 2, la CTS en moyenne à partir d&#39;un échantillon de KSHV négatif exécuté en quatre exemplaires sont présentés. Surtout, KSHV LANA n&#39;a pas été détectée dans cet échantillon par le tableau qPCR hautement sensible. Toutefois, U6 - notre contrôle interne et laissez-7a - hautement exprimé humaines pré-microARN, ont été exprimées à des niveaux détectables. Enfin, comme prévu, le contrôle négatif de la PCR-grade de l&#39;eau n&#39;a pas le rendement d&#39;un produit qPCR. Un autre indicateur d&#39;une exécution réussie qPCR est une analyse fondre une bonne courbe, ce qui peut donner un aperçu de la contamination potentielle dans les échantillons. Pour établir une température de fusion, la plaque est chauffée lentement après la PCR est terminée. Comme les brins d&#39;ADN séparés, SYBR green est libéré, et le signal de fluorescence diminue. La température à laquelle ce drop se produit est tracée, et est connue comme la température de fusion de l&#39;échantillon. Selon la séquence d&#39;ADN, les échantillons fondent à des températures différentes les unes des autres et de la maîtrise de l&#39;eau négative, ce qui ne devrait pas avoir une température de fusion puisque aucun ADN est présent. Les produits de PCR de chaque paire d&#39;amorces devraient fondre à des températures similaires. Par exemple, la figure 3 montre une analyse de la courbe de fusion de deux amorces différentes utilisant le même échantillon en double exemplaire. Il est clair que la température de fusion est différente pour les deux paires d&#39;amorces, mais l&#39;échantillon est fondant à la température exactement le même pour chaque réplique. Les signes d&#39;un mauvais échantillon ou potentiellement contaminés peut inclure plusieurs pics de fusion, ce qui suggère la présence de deux sources différentes de l&#39;entrée. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Pré-microARN signatures émerger à travers l&#39;aide d&#39;un profilage basé sur roman de qPCR tableau. Le deltaCTU6 moyenne a été calculée et les valeurs standardisées ont été chargés dans le logiciel ArrayMinerTM, produisant trois groupes distincts affiché comme heatmaps. (A) pré-microARN avec de petits changements dans l&#39;expression sont affichées. Pré-microARN dont les niveaux étaient significativement diminué (B) ou augmenté (C) sont également représentées. Le bleu correspond à des niveaux inférieurs d&#39;expression tandis que le rouge représente augmenté les niveaux d&#39;expression. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Inclusion des contrôles internes dans le qPCR à base de pré-microARN tableau. Les valeurs brutes CT pour 3 gènes différents et un contrôle de modèle ne sont affichés. U6 est utilisé comme un contrôle positif interne tandis PCR H2O nous sert de contrôle négatif. Laissez-7a-1-1 est un microARN normalement exprimé dans de nombreux types cellulaires différents tout KSHV LANA peut être utilisé soit comme un contrôle positif ou négatif, fondée sur le statut viral de la lignée cellulaire ou tissu utilisé. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Fusion d&#39;analyse de pointe de pré-microARN amorces et l&#39;absence de contamination des échantillons. Courbes de fusion ont été obtenues en utilisant l&#39;analyse appelant Tm dans le logiciel LightCycler. Deux amorces différentes (Primer A et B) pour le même échantillon analysés en double sont affichés. La température de fusion pour chaque amorce est distincte. Toutefois, l&#39;échantillon a une seule pointe, démontrant l&#39;absence de contamination des échantillons.

<ol>
	<li>Bustin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments.">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Fr&#233;geau, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Processing+of+Forensic+Casework+Samples+using+Robotic+Workstations+Equipped+with+Nondisposable+Tips+-+Contamination+Prevention.">Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips - Contamination Prevention.</a> J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).</li><li>O'hara, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-micro+RNA+Signatures+Delineate+Stages+of+Endothelial+Cell+Transformation+in+Kaposi+Sarcoma.">Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).</li></ol>

QPCR est un test très sensible qui peuvent être utilisés pour comparer les niveaux d&#39;expression génique entre les échantillons dans une étude, ainsi que pour déterminer la positivité dans le cas des virus. L&#39;avantage d&#39;utiliser des tableaux qPCR est la capacité d&#39;exécuter de nombreuses amorces (dans notre cas, 186 paires d&#39;amorces) pour chaque échantillon dans un court laps de temps. L&#39;utilisation d&#39;un robot de pipetage tels que l&#39;Evo Tecan Freedom, le montant de temps requis p...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Freedom Evo 150</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tecan</td>
<td>30017587</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Matrix Electronic Multichannel Pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>2001-MTX</td>
<td>(or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above)</td>
</tr>
<tr>
<td>Matrix Integrity Filter Tips, Sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>7435</td>
<td>(or comparable tip for multichannel used)</td>
</tr>
<tr>
<td>Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04 707 516 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lightcycler 480 Instrument II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05015243001</td>
<td>384-well version</td>
</tr>
<tr>
<td>Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04729749001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LightCycler 480 Sealing Foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04729757001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05075122001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eliminase Decontaminant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Decon Laboratories</td>
<td>04-355-31</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

profiling of pre-micro rnas and micrornas using quantitative real-time pcr (qpcr) arrays

Quantitative PCR en temps réel (QPCR) a émergé comme un outil précis et précieux dans le profilage des niveaux d&#39;expression génique. Un de ses nombreux avantages est une limite inférieure de détection par rapport à d&#39;autres méthodes de profilage de l&#39;expression des gènes en utilisant de petites quantités d&#39;entrée pour chaque dosage. Automatisé de configuration qPCR a amélioré ce domaine en permettant une plus grande reproductibilité. Sa mise en pratique et rapide permet d&#39;expériences à haut débit, permettant le profilage de nombreux gènes différents simultanément dans chaque expérience. Cette méthode avec des contrôles plaque interne réduit également les variables expérimentales communes à d&#39;autres techniques. Nous avons récemment développé un test de PCR quantitative pour le profilage de la pré-microARN (pré-miARN) en utilisant un ensemble de 186 paires d&#39;amorces. Les microARN sont apparus comme une nouvelle classe de petits ARN non-codants avec la capacité de réguler les cibles ARNm nombreuses au niveau post-transcriptionnel. Ces petits ARN sont d&#39;abord transcrit par l&#39;ARN polymérase II comme un miARN primaires (PRI-miARN) transcription, qui est ensuite clivé dans le miARN précurseur (pré-miARN). Pré-miARN sont exportés vers le cytoplasme où Dicer clive la boucle en épingle à cheveux à céder miARN matures. L&#39;augmentation des niveaux de miARN peuvent être observées à la fois le précurseur et le niveau miARN matures et de profilage de ces deux formes peuvent être utiles. Il existe plusieurs dosages disponibles commercialement pour miARN matures, mais leur coût élevé peut dissuader les chercheurs de cette technique de profilage. Ici, nous discutons d&#39;un bon rapport coût-efficacité, la fiabilité, la méthode qPCR SYBR à base de profilage de pré-miARN. Les changements dans les niveaux de pré-miARN sont souvent le reflet des changements miARN mature et peut être un indicateur utile de l&#39;expression du miARN mature. Toutefois, le profilage simultané des deux pré-miARN et miARN mature peut être optimale, car ils peuvent apporter des informations non redondantes et de donner un aperçu du traitement de microARN. Par ailleurs, la technique décrite ici peut être étendu pour englober le profilage des ensembles d&#39;autres bibliothèques pour les voies spécifiques ou des agents pathogènes.

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Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Nous allons démontrer la configuration et l&#39;analyse des pré-microARN de 96 puits pour les tableaux QPCR aide d&#39;un robot ainsi que par la main avec une pipette multicanaux Thermo Scientific Matrix.

Profilage de la pré-micro ARNs et micro-ARN en utilisant quantitative PCR en temps réel (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

profiling-pre-micro-rnas-micrornas-using-quantitative-real-time-pcr

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

17.2K vues.  University of North Carolina at Chapel Hill. Nous allons démontrer la configuration et l'analyse des pré-microARN de 96 puits pour les tableaux QPCR aide d'un robot ainsi que par la main avec une pipette multicanaux Thermo Scientific Matrix.

Vidéo: Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitative PCR en temps réel utilisant le Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Recherche

Biologie

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Analyse de l&#39;expression génique dans l&#39;agrile du frêne ( Agrilus planipennis) En utilisant quantitative en temps réel-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Détermination des profils d&#39;expression génétique dans les C. elegans Utilisation microréseaux et PCR en temps réel

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

Quantitative, en temps réel Analyse de l&#39;activité de réparation par excision de base dans les lysats cellulaires Utilisant des lésions spécifiques Beacons moléculaires

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profilage individuel embryonnaires humaines Cellules souches par RT-PCR quantitative

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Temps réel Mesures de Membrane Protein Receptor Interactions: Utilisation de résonance plasmonique de surface (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

PCR en temps réel basée sur une sonde Approches de mesure quantitative des microARN

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Analyse qPCRTag - un débit élevé, PCR temps réel pour Sc2.0 Génotypage

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

Quantification absolue des micro-ARN plasmatique chez les singes Macaques, à l’aide de la Transcription inverse en temps réel Quantitative PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

Surveillance en temps réel de l’activation de l’aurora kinase A à l’aide de biocapteurs FRET conformationnels dans des cellules vivantes

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...