Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de l’immunité pulmonaire sur la façon d’évaluer l’expression des microARN qui sont prévus pour réguler les gènes inflammatoires dans le poumon. Cette technique offre le moyen simple d’identifier les contributions des hormones circulantes à l’expression des microARN pulmonaires. Pour évaluer le stade du cycle estrous, retenez manuellement une souris femelle de huit à neuf semaines et introduisez la pointe d’une pipette en plastique de 10 microlitres remplie d’eau ultra pure dans le vagin.
Rincer délicatement quatre à cinq fois pour recueillir un échantillon et déposer la dernière bouffée de liquide vaginal sur une glissière en verre. Ensuite, observez la chasse vaginale non tachée sous un microscope léger au grossissement 20X. Pour les expositions à l’ozone et à l’air filtré, placez un maximum de quatre souris dans l’un des deux contenants individuels en verre de 1,2 litre avec couvercles en maille métallique.
Mettez un récipient en verre dans une chambre d’ozone et un dans une chambre filtrée d’exposition à l’air. Réglez ensuite la concentration d’ozone à deux parties par million, en enlevant le récipient après trois heures. Quatre heures après l’exposition, désinfectez la surface de peau exposée de la première souris expérimentale avec 70% d’éthanol et coupez la cage thoracique pour exposer le cœur et les poumons.
Utilisez des forceps pour plonger un tube de micro centrifugeuse sans RNase de 1,5 millilitre dans l’azote liquide et casser le poumon récolté dans l’azote liquide. Ensuite, utilisez un pulvérisateur de tissu en acier inoxydable pour mascerate l’ensemble du poumon, et diviser le tissu pulvérisé entre deux tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Après avoir récolté et pulvérisé les poumons de tous les animaux de la même manière, ajoutez 500 microlitres de thiocyanate de guanidinium à chaque échantillon et homogénéisez séquentiellement chaque tissu avec des aiguilles de calibre 18, 21 et 23.
Après la dernière homogénéisation, ajouter 500 microlitres d’éthanol à chaque échantillon avant de vortexer pendant 15 secondes. Chargez les mélanges dans des colonnes de spin individuelles dans des tubes de collecte individuels pour la centrifugation et jetez les écoulements. Pour le traitement DNase 1, ajouter 400 microlitres de tampon de lavage d’ARN à chaque colonne pour une autre centrifugation et mélanger cinq microlitres de DNase 1 et 75 microlitres de tampon de digestion de l’ADN par échantillon dans les tubes sans RNase.
Ajouter le mélange directement aux matrices de colonne pour une incubation de 15 minutes à température ambiante, suivie de deux lavages de solution de prélavage d’ARN de 400 microlitres par centrifugation. Pour élucider l’ARN, ajouter 35 microlitres d’eau sans DNase RNase directement à chaque matrice de colonne pour une centrifugation finale, et mesurer la concentration totale d’ARN et la pureté de chaque échantillon sur un spectrophotomètre. Ensuite, stockez l’ARN à moins 80 degrés Celsius.
Pour la rétrotranscription de la petite RNase, ajouter 200 nanogrammes d’ARN total dans 10 microlitres de solution de prélavage à un tube de mélange de réaction de transcription inverse par échantillon. Après le mélange, centrifugez brièvement les échantillons et placez-les sur la glace jusqu’à leur incubation. Ensuite, incuber les tubes pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius, suivie d’une incubation de cinq minutes à 95 degrés Celsius.
À la fin de la deuxième incubation, diluer le CDNA avec 200 microlitres d’eau sans RNase par réaction de transcription inverse de 20 microlitres, et ajouter 10 microlitres de chaque échantillon de mélange de réaction à chaque puits d’une réponse inflammatoire préchargée de souris et d’un tableau pcr microARN auto-immunité. Le stade proéstrus peut être identifié par la présence de cellules épithéliales nucléées rondes et bien formées. Lorsque la souris est au stade de l’estrus, des amas densément emballés de cellules épithéliales anucléifiées, cornifiées et squameuses sont observés dans le frottis.
Pendant les métastrus, on voit des cellules épithéliales cornifiées et des leucocytes polymorphonucléaires. Chez les diestrus, les leucocytes sont généralement plus répandus. L’ARN extrait de quatre poumons de souris, comme démontré, présentent des concentrations d’acide nucléique variant entre 1198 et 2178 nanogrammes par microlitre et un rapport moyen A260/A280 entre 2,01 et 2,02, et un rapport moyen A260/A230 entre 2.139 et 2.223.
Dans ce tableau, les changements doubles de l’expression du microARN entre l’ozone et les souris exposées à l’air filtré sont indiqués. Après le filtre cible microARN et l’analyse de base de 14 microARN, afin d’obtenir le rapport de journal d’expression significatif et les valeurs P, ces données peuvent être cartographiées par le filtre cible microARN. L’analyse de base fournit également de l’information sur les voies canoniques, les maladies et la fonction, les organismes de réglementation et les réseaux.
En outre, le logiciel d’analyse fonctionnelle peut être utilisé pour produire une analyse réseau qui montre la relation entre les microARN d’intérêt et d’autres molécules. Tout en essayant cette procédure, il est important de vérifier le cycle de l’estrus quotidiennement pendant au moins trois cycles consécutifs avant de mener une expérience. Après cette procédure, d’autres méthodes peuvent être exécutées pour répondre à des questions supplémentaires au sujet de l’expression inflammatoire de gène de poumon à travers le cycle d’estrus.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie à d’autres chercheurs dans le domaine de l’immunité pulmonaire pour explorer les mécanismes de régulation des hormones sexuelles en utilisant d’autres modèles.
