PDK est soutenu par une subvention de fonctionnement des IRSC (MOP 86523)

1. Technique chirurgicale <ol><li> Les expériences doivent être effectuées en utilisant une technique aseptique et en suivant les protocoles d&#39;utilisation d&#39;animaux de votre institution spécifique. Instruments et matériel (solutions, des substances d&#39;essai, traceurs, aiguilles, etc) entrant en contact avec des tissus vivants doivent être stériles pour prévenir l&#39;infection et les effets néfastes sur le bien-être animal et les impacts négatifs potentiels sur l&#39;étude. </li></ol> 2. Anesthésie <ol><li> Les rats anesthésiés sera en utilisant un système de vaporisateur vétérinaire isoflurane. Utiliser l&#39;oxygène de qualité médicale à un débit de 0,8 L / min pour vaporiser le gaz isoflurane. Placez l&#39;animal dans la boîte ci-joint l&#39;anesthésie et de composer dans une concentration d&#39;isoflurane de 4% jusqu&#39;à ce que la respiration s&#39;est ralentie et l&#39;animal est calme. </li><li> Ensuite, changer le débit de gaz à la fixation du masque à gaz pour cadre stéréotaxique et placer l&#39;animal dans l&#39;appareil de stéréotaxie. Tournez la concentration d&#39;isoflurane à 2% et lun.anesthésie moniteur. Les plus gros animaux (&gt; 300 g) peut exiger une plus forte concentration d&#39;isoflurane. L&#39;anesthésie doit être surveillée pendant la chirurgie et la posologie ajustée en conséquence l&#39;isoflurane. Profondeur et la vitesse de la respiration doit être constamment évaluée, et l&#39;évaluation pincement de l&#39;orteil (toutes les 5 min) pour l&#39;absence de douleur profonde doit être effectuée. </li><li> Une fois que l&#39;opération est terminée, éteignez l&#39;isoflurane et permettre à l&#39;animal à l&#39;oxygène respiration pendant plusieurs minutes avant de le retirer de l&#39;appareil stéréotaxique. La température du corps doit être maintenu en couvrant l&#39;animal avec une couverture chirurgicale et / ou à l&#39;aide d&#39;une couverture chauffante régulée pendant la chirurgie. </li></ol> 3. Abord chirurgical <ol><li> Mouiller la fourrure sur le dessus de la tête avec de l&#39;éthanol 70% pour rendre le plus facile à couper la fourrure. Enlever les poils d&#39;entre les yeux à l&#39;aide d&#39;une tondeuse ou des ciseaux bien aiguisés. Nettoyez la zone d&#39;incision à trois reprises avec des applications alternatives de solution détergente iode (Proviodine, bétadine, etc) followed par l&#39;éthanol à 70%. Maintenir la cornée humide tout au long de l&#39;opération en appliquant une pommade ophtalmique oeil (Tears Naturale PM) à la cornée. Propager la pommade sur la surface de la cornée par l&#39;ouverture manuelle et de fermeture des paupières. </li><li> N ° 11 l&#39;aide d&#39;une lame, faire une incision le long de la ligne médiane de la tête d&#39;environ 0,5 cm à l&#39;avant des yeux à 1 cm derrière les yeux. Rétracter le lambeau de peau sur l&#39;œil en utilisant une pince et doucement taquiner le mouchoir sous-jacente conjonctif avec le dos du scalpel. Ensuite, retirer le lambeau de peau latéralement et vers le bas et maintenez en place avec un écarteur chirurgical qui peut être collé sur la base de l&#39;instrument stéréotaxique. </li><li> Faire une incision le long du bord supérieur de l&#39;os orbital tout en tirant sur le fascia recouvrant avec des pinces acérées. Cela retirer le fascia l&#39;orbite de l&#39;œil. Le bord de l&#39;os orbital peut être clairement délimitées à l&#39;aide de pinces pour pousser vers le bas sur le fascia recouvrantl&#39;orbite. L&#39;utilisation d&#39;un dispositif de cautérisation ou un scalpel, continuer l&#39;incision en arrière vers la limite postérieure de l&#39;orbite de l&#39;œil. Utiliser l&#39;os de l&#39;orbite supérieure comme un guide pour l&#39;incision. Suivant poursuivre les attaquants incision vers la limite antérieure de l&#39;orbite. L&#39;incision de l&#39;orbite supérieure mieux est d&#39;utiliser un dispositif de cautérisation de petite taille afin de prévenir l&#39;hémorragie des vaisseaux sous-jacents qui communiquent avec les sinus veineux. </li><li> Si le saignement se produit plusieurs mesures peuvent être prises. Tout d&#39;abord, appliquer une pression à l&#39;aide des écouvillons stériles chirurgicaux ou des cotons-tiges. Si le saignement continue, appliquer du froid, une solution saline stérile de tampon phosphate (PBS) à la surface en utilisant un compte-gouttes, et maintenir la pression. Des saignements mineurs s&#39;arrête après quelques secondes en utilisant cette procédure. Si le saignement persiste, appliquer une traction sur le tissu avec le tampon chirurgical ou coton-tige afin d&#39;identifier la source du saignement et rapidement cautériser le vaisseau compromise. Après la saignée est contenu, utilisez stérile à froide PBS pour nettoyer la zone chirurgicale de sang. La zone chirurgicale doit être régulièrement nettoyé de cette façon afin de mieux visualiser les structures dans l&#39;orbite de l&#39;œil. </li><li> Une fois l&#39;incision a été nettoyé, utiliser des forceps et le dos du scalpel pour nettoyer le tissu conjonctif à l&#39;arrière de l&#39;œil qui recouvre le contenu orbitales. L&#39;arrière de la n ° 11 de scalpel fonctionne bien comme la pointe est fine. Cela permettra d&#39;ouvrir des portions plus profondes de la cavité orbitaire fournissant une plus grande fenêtre chirurgicale pour travailler po utilisation Dumont # 7b arêtes dentelées pince courbée lorsque vous travaillez dans l&#39;œil que leur courbure et pointes fines sont idéales pour manipuler les structures de l&#39;orbite. En outre, les dentelures aider avec les structures de préhension. </li><li> Ensuite, retirez le tissu conjonctif qui entoure la division ophtalmique du nerf trijumeau, qui se trouve près de la ligne médiane, et enlever le nerf aide d&#39;une pince. Cette étape n&#39;est pas nécessaire, cependant enlever le nerf offrira une plus grande fenêtre d&#39;accèss vers le nerf optique plus tard. </li><li> Après l&#39;élimination du nerf, utilisez une pince pour retirer le vaisseau sanguin ci-dessous et complètement cautériser le vaisseau. Cette étape n&#39;est pas non plus nécessaire, cependant cautérisation du navire lui permet d&#39;être déplacé en avant, créant ainsi une plus grande fenêtre une fois que le nerf optique est atteint. </li><li> Utilisez une paire de pinces, forte ou une pince qui ont eu leurs conseils courbées vers l&#39;intérieur à choisir soigneusement et enlever la mince couche de tissu conjonctif des muscles extra-oculaires et la glande lacrymale. Rentrez les muscles oculaires supplémentaires d&#39;avant en arrière de l&#39;orbite. Saisir la partie proximale du muscle avec une paire de pinces et en utilisant une deuxième paire de pinces dentelées courbes de pansements oculaires à exercer une traction vers l&#39;extérieur sur le muscle. Faire en sorte que les pinces à pansement oculaire sont orientées dans la même direction que lors de l&#39;extraction du muscle, afin d&#39;éviter la déchirure. Retirer le muscle le plus antérieur de l&#39;orbite (Superior oblique) de cette manière. Le muscle sera libéraliséATED au plus profond de l&#39;orbite et la longueur restante peut être rétracté afin de faire tourner l&#39;oeil vers l&#39;extérieur. </li><li> Répétez l&#39;étape 3.8 avec le muscle suivante (rectus médial) qui se trouve entre les lobes de la glande lacrymale et la glande de Harder près de la ligne médiane de la face dorsale de l&#39;œil. Bande vers le bas l&#39;enrouleur pour maintenir la traction sur les muscles. </li><li> Retirez doucement le tissu conjonctif restant sur la surface de la glande lacrymale et soulevez la glande vers le haut en utilisant une pince. Ne pas compresser ou de presser la glande. Pour rétracter la glande, seulement un seul récipient au pôle postérieur doit être cautérisé. Soulever l&#39;extrémité postérieure de la glande vers le haut, et ensuite cautériser le vaisseau. </li><li> Ensuite, battre la glande lacrymale avant d&#39;ouvrir la partie postérieure de l&#39;orbite et de permettre un accès sans entrave aux muscles qui recouvrent le nerf optique. Gardez la zone humide en permanence à l&#39;aide du PBS stérile et séchage avec des tampons chirurgicaux ou des cotons-tiges. </li><li> Utilisation sharpe Pince à nouveau enlever le tissu conjonctif qui entoure mince muscles de l&#39;orbite postérieure (releveur paupière supérieure et droit supérieur) et de séparer les faisceaux de muscles sous-jacents. Rentrez les muscles indépendamment ou à l&#39;unisson, à l&#39;aide des pinces courbes dentelées pansements oculaires, encore une fois, en tirant dans le sens des fibres musculaires. Fixez les longueurs musculaires restantes à l&#39;enrouleur avec les muscles qui ont été rachetées dans les étapes 3.8 et 3.9 et la bande vers le bas l&#39;enrouleur pour appliquer une traction. Un total de 4 muscles vont maintenant être attaché à l&#39;enrouleur. Cela fera tourner les yeux vers l&#39;avant et vers l&#39;extérieur dans le but de révéler la gaine contenant la graisse qui entoure le nerf optique. </li></ol> 4. Accès au nerf optique <ol><li> Utilisez une pince fine pointe pointus (Dumont) pour tirer vers le haut sur le tissu conjonctif qui entoure la gaine graisseuse du nerf optique. Faites une coupe longitudinale à l&#39;aide de petits ciseaux à ressort Vannas. Développer la coupe si nécessaire. Thmatière grasse contenue e par la gaine va commencer à gonfler une fois la coupe terminée. Prochaine enlever les pans de tissu conjonctif en tirant avec précaution vers le haut à partir du bord coupant et les rabats de tissu en forme de croissant. </li><li> Retirez la graisse recouvrant le nerf optique à l&#39;aide d&#39;une pince pour tirer sur la graisse, tout en coupant avec des ciseaux à ressort Vannas. Garder la zone propre en utilisant du PBS stérile et tampons chirurgicaux pour nettoyer les petites quantités de sang qui découlent de l&#39;ablation du tissu. </li><li> Le nerf optique est maintenant visible. Pour accéder au nerf, la gaine méningée qui entoure le nerf doit être enlevé sans endommager l&#39;artère ophtalmique qui nourrit la rétine interne. Examinez le motif de la gaine vasculaire méningée aide d&#39;une pince à tourner doucement la gaine. Recherchez une zone dépourvue de vaisseaux sanguins et en permettant une coupe longitudinale à faire dans la gaine méningée. </li><li> Utilisation pointe fine pince Dumont, pincer la dure-mère et tirer vers le haut. Près de la base ee coin triangulaire en forme de durée qui est créé, utilisez des ciseaux à ressort Vannas de faire une petite incision dans la gaine. Insérez la lame inférieure des ciseaux dans l&#39;incision et couper la gaine parallèle à la direction du nerf optique, veillez à ne pas endommager le système vasculaire avec découpes latérales. Utiliser les pinces et des ciseaux à draper la durée de chaque côté du nerf optique. </li><li> La seule couverture restante du nerf est la membrane arachnoïde. Il est très mince et transparente. Afin de déterminer si la membrane est toujours présent, l&#39;utilisation de pinces pointues pour pincer la surface du nerf. Il l&#39;arachnoïde est présent, pincer la membrane et tirer vers le haut pour créer un coin triangulaire de tissu. Effectuer une petite incision avec la pointe des ciseaux similaires à l&#39;étape 4,4. Ensuite, insérez la lame inférieure des ciseaux et faire une coupe longitudinale dans l&#39;arachnoïde. Ensuite, utilisez vos ciseaux et des pinces à draper l&#39;arachnoïde de chaque côté du nerf optique. </li><li> En utilisant un micro sur-gique crochet, élever le nerf optique de la gaine méningée. Passez la pointe du crochet autour du bord externe du nerf et assurez-vous que le crochet reste en contact avec le nerf de sorte que vous n&#39;avez pas attraper les membranes méningées avec le crochet et accidentellement transect. Soulevez délicatement le nerf optique de la gaine méningée et complètement sectionner le nerf derrière le point pris en charge par le crochet. Le moignon du nerf sectionné optique auront désormais une extrémité libre, permettant le retrait de l&#39;hameçon. </li><li> Si les CGR vont être marqués de façon rétrograde dans le but de quantifier la survie, placez un petit morceau de gelfoam trempé dans Fluorogold 3% (ou un autre traceur rétrograde) sur le moignon du nerf optique sectionné (voir <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2261">JoVE protocole de 2261</a> ). </li></ol> 5. De clôture et de récupération <ol><li> Soulager la traction sur les muscles oculaires supplémentaires et retourner l&#39;oeil à une position neutre. Ce faisant, assurez-vous que les to pousser le gelfoam vers le bas dans l&#39;orbite de l&#39;œil pour s&#39;assurer que l&#39;œil est tourné le remettre en place, le reste gelfoam autour du moignon du nerf optique. Retour la glande lacrymale et les muscles oculaires supplémentaires à leurs positions naturelles. </li><li> Retournez le lambeau de peau sur la ligne médiane et suturer la plaie. Appliquer une pommade ophtalmique à l&#39;œil les deux yeux. Ensuite, éteignez la source de l&#39;isoflurane et permettre à l&#39;animal à l&#39;oxygène respiration pendant plusieurs minutes. Placer l&#39;animal dans une cage ou une cage chauffé sous une lampe chauffante à récupérer. Ne placez pas de linge de lit dans la cage de récupération pour éliminer le risque d&#39;aspiration de literie lors de la récupération. </li><li> Les animaux doivent être logés de façon indépendante après la chirurgie. Analgésiques post-opératoire doit être administré selon les directives de votre administration de soins aux animaux, et les animaux doivent être surveillés attentivement après la chirurgie. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Transection des résultats du nerf optique dansla perte de 90% des CGR blessés dans les 14 jours postaxotomy 9-11. Le principal mécanisme de la mort RGC est l&#39;apoptose 9, 12. La densité normale des CGR est d&#39;environ 2500 cellules / mm 2. D&#39;imagerie à épifluorescence ou confocale peut être utilisé pour visualiser CGR marqués de façon rétrograde après axotomie. RGC apoptose est retardé d&#39;environ 4 jours après axotomie, en laissant une fenêtre de temps pour les manipulations expérimentales. Moins 1 jour après axotomie et marquage rétrograde avec Fluorogold, les corps cellulaires RGC dans la couche des cellules ganglionnaires de la rétine et fascicules axones dans la couche des fibres nerveuses de la rétine sont clairement visibles lorsque l&#39;imagerie une préparation flatmounted (figure 1a). En 14 jours après axotomie, la majorité des CGR sont morts, et un CGR quelques autres sont intercalées entre la rétine microglie (figure 1b). Lorsque CGR apoptose, les microglies phagocytose des cellules mortes et, par conséquent deviennent transcellularly étiqueté avec le traceur fluorescent qui a été utilisé pour étiqueter le CGR 13, 14 &lt;/ Sup&gt;. L&#39;apparition du traceur dans les phagosomes de cellules microgliales est différente de celle de CGR survivants. La microglie contenir le traceur dans les phagosomes très concentrés et très lumineux qui sont relativement grands et dispersés dans le cytoplasme (figure 1c). CGR ont un modèle plus diffuse de la coloration (figure 1c) avec ponctuées de petites vésicules qui ont été transportés par voie rétrograde vers le bas leurs axones classeurs cytoplasme de la cellule. Ces vésicules sont beaucoup plus petites et ont moins intense fluorescence permettant de différencier CGR survivants de la microglie. En outre, les microglies ont des corps cellulaires beaucoup plus petites et ont tendance à avoir une morphologie stellaire ou amiboïdes, par opposition à RGC qui ont un corps cellulaires relativement grandes et arrondies. Les arbres dendritiques de CGR peut aussi aider à les différencier des processus courts vives de la microglie, lors de la quantification survie cellulaire. La survie des cellules peut être quantifié dans les différentes régions de la rétine et de la densité (cellules / mm 2) peut être EXTRAPOLés de la zone des micrographies correspondantes, depuis RGC se trouvent dans une monocouche à l&#39;intérieur de la couche des cellules ganglionnaires. <img src="/files/ftp_upload/2241/2241fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Micrographies épifluorescence de Fluorogold CGR marquées après axotomie et l&#39;application du traceur sur le moignon du nerf optique. (A) 1 jour après axotomie CGR et leurs fascicules axones sont étiquetés avec le traceur d&#39;une manière bien ponctuée. (B) En 14 jours après axotomie, 90% des CGR sont mortes et vives étiquetés microglies qui ont phagocyté les cellules mortes sont également marqués avec le traceur. (C) Grossissement supérieur montrant la différence entre CGR et la microglie (flèches rouges) à 14 postaxotomy jours. La barre d&#39;échelle en A et B est de 50 um. La barre d&#39;échelle en C est de 25 um.

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Il existe de nombreuses variantes de cette intervention chirurgicale et plusieurs des étapes de ce protocole ne sont pas nécessaires. Il est seulement nécessaire de rétracter les muscles qui recouvrent le nerf optique, afin d&#39;avoir accès au nerf. Toutefois, cela se traduit par un espace très limité de travail autour du nerf rendant les phases critiques finales de transection plus difficile. Dans certaines situations, il est souhaitable de transfecter les cellules de la souche du nerf optique et l&#39;espace d...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd"><html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en"><div><table border="1"><thead><tr><th> Nom du produit </th><th> Type </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commenter </th></tr></thead><tbody><tr><td> Cadre stéréotaxique </td><td></td><td> Stoelting, Kopf, WPI </td><td></td><td></td><tr><td> Masque à gaz Rat </td><td></td><td> Stoelting, Kopf, WPI </td><td></td><td></td><tr><td> Système d&#39;anesthésie </td><td></td><td> VetEquip </td><td> 901806 </td><td></td><tr><td> L&#39;isoflurane (Pr AErrane) </td><td></td><td> Baxter Corp </td><td> DIN 02225875 </td><td></td><tr><td> Microscope chirurgical </td><td></td><td> WPI, Zeiss, Leica </td><td></td><td></td><tr><td> Fluorogold - (Hydroxystilbamidine bis (methanesulfonate) </td><td></td><td> Sigma </td><td> 39286 </td><td></td><tr><td> Gelfoam </td><td></td><td> Pharmacia &amp; Upjohn </td><td></td><td></td><tr><td> Tears Naturale PM </td><td></td><td> Alcon </td><td></td><td></td><tr><td> Proviodine </td><td></td><td> Medline </td><td> MDS093945H </td><td></td><tr><td> Vannas ciseaux à ressort </td><td></td><td> Outils Fine Science </td><td> 15000-00 </td><td></td><tr><td> Pointe fine pince Dumont </td><td></td><td> Outils Fine Science </td><td> 11252-00 </td><td></td><tr><td> Micro crochet chirurgical </td><td></td><td> Outils Fine Science </td><td> 10062-12 </td><td></td><tr><td> Eye pansement dentelé pince </td><td></td><td> Outils Fine Science </td><td> 11152-10 </td><td></td><tr><td> Dumont # 7b forte courbe en dents de scie pince </td><td></td><td> Outils Fine Science </td><td> 11270-20 </td><td></td><tr><td> Cauterizer </td><td></td&gt; <td> Outils Fine Science </td><td> 18010-00 </td><td></td></tbody></table></div>

optic nerve transection: a model of adult neuron apoptosis in the central nervous system

Les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) sont des neurones du système nerveux central que l&#39;information de sortie visuelle de la rétine au cerveau, via le nerf optique. Le nerf optique peut être consulté dans l&#39;orbite de l&#39;oeil et complètement sectionné (axotomisés), couper les axones de toute la population RGC. Section du nerf optique est un modèle reproductible de la mort cellulaire par apoptose neuronale dans le SNC adulte 1-4. Ce modèle est particulièrement intéressant car la chambre vitrée de l&#39;œil agit comme une capsule pour l&#39;administration de médicaments à la rétine, ce qui permet des manipulations expérimentales par des injections intraoculaires. La diffusion de produits chimiques dans le corps vitré assure qu&#39;ils se fondent sur l&#39;ensemble de la population RGC. En outre, RGC peut être sélectivement transfectées par l&#39;application de courtes ARN interférents (ARNsi), des plasmides ou des vecteurs viraux, de l&#39;extrémité coupée des vecteurs du nerf optique ou 5-7 injecter dans leur cible, le colliculus supérieur 8. Cela permet aux chercheurs d&#39;étudiermécanismes apoptotiques dans la population neuronale souhaitée sans effets confondants sur les neurones ou des cellules gliales autres spectateurs environnant. Un autre avantage est la facilité et la précision avec laquelle la survie des cellules peut être quantifié après une blessure. La rétine est un plat, tissu couches et CGR sont localisés dans la couche la plus profonde, la couche des cellules ganglionnaires. La survie des RGC peut être suivie dans le temps par l&#39;application d&#39;un traceur fluorescent (3% Fluorogold) à l&#39;extrémité coupée du nerf optique au moment de l&#39;axotomie, ou par injection du traceur dans le colliculus supérieur (cible RGC) une semaine avant l&#39; axotomie. Le traceur est transporté par voie rétrograde, l&#39;étiquetage de toute la population RGC. Parce que la couche des cellules ganglionnaires est une monocouche (une cellule d&#39;épaisseur), la densité du CJR peuvent être quantifiés dans le tissu plat monté, sans la nécessité d&#39;stéréologie. Section du nerf optique conduit à la mort par apoptose de 90% des CGR blessés dans les 14 jours postaxotomy 9-11. Apoptose RGC a une caractéristique temps-cours whereby mort cellulaire est retardé 3-4 postaxotomy jours, après quoi les cellules dégénèrent rapidement. Ceci permet d&#39;obtenir une fenêtre de temps pour les manipulations expérimentales dirigés contre les voies de l&#39;apoptose.

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Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Section du nerf optique est un modèle largement utilisé de lésion du SNC adulte. Quatre-vingt dix pour cent des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) dont les axones sont complètement sectionné (axotomie) meurent dans les 14 jours après axotomie. Ce modèle est facilement prêter à des manipulations expérimentales et hautement reproductibles.

Section du nerf optique: un modèle de l&#39;apoptose neuronale des adultes dans le système nerveux central

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.5K vues.  University of Toronto. Section du nerf optique est un modèle largement utilisé de lésion du SNC adulte. Quatre-vingt dix pour cent des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) dont les axones sont complètement sectionné (axotomie) meurent dans les 14 jours après axotomie. Ce modèle est facilement prêter à des manipulations expérimentales et hautement reproductibles.

Vidéo: Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Méthodes de manipulations expérimentales après section du nerf optique dans le SNC des mammifères

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Recherche

Neurosciences

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagerie multimodale d&#39;implantation de cellules souches dans le système nerveux central de souris

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Étiquetage des cellules isolées dans le système nerveux central des<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Livraison intraventriculaire directe des médicaments pour le système nerveux central rongeurs

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

En Interrogation in vivo de système nerveux central Translatome par polyribosome fractionnement

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

Enregistrement Potentiel évoqué visuel dans un modèle de rat of Experimental Optic Nerve démyélinisation

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing optique du système nerveux central de souris utilisant CLARITY passive

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection is considered a useful and reproducible model. Compared with other optic nerve injury models used commonly for assessing secondary degeneration, e.g. complete optic nerve transection and optic nerve crush models, the partial optic nerve transection model is superior as it distinguishes primary from secondary degeneration in situ. Therefore, it serves as an excellent tool for evaluating secondary degeneration. This study describes a novel operative approach of partial optic nerve transection by directly accessing the area of the retrobulbar optic nerve through the orbital lateral wall of the eyeball. Moreover, we present a newly designed, low cost surgical instrument to assist with transection. As demonstrated by the representative results in distinguishing the boundary of primary and secondary injury areas, the new approach and instrument ensures high efficiency and stability of the model by providing adequate space for surgical operation. This in turn makes it easy to separate the meningeal sheath and ophthalmic vessels from the optic nerve before transection. An additional benefit is that this space-saving operative approach improves the investigators&#39; ability to administer drugs, carriers, or selective RGC tracers to the stump of the partially transected optic nerve, allowing the exploration of mechanisms behind secondary injury in RGCs, in a new way.

Secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. This study describes an innovative operative approach for partial optic nerve transection. The use of this space-saving operative approach extends the model's application range, and allows exploration of secondary injury mechanisms in RGCs in a new way.

Résection partielle du nerf optique chez le rat : un modèle mis en place avec une nouvelle approche du dispositif d’évaluation secondaire dégénérescence des cellules ganglionnaires rétiniennes

Previous studies have shown that the secondary degeneration of retinal ganglion cells (RGCs) occurs commonly in glaucoma. Partial optic nerve transection ...

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with neurodegenerative diseases or injuries, but also in the normal brain. Here, we describe a newly-established micromechanical system to rapidly, reliably, and reversibly induce axonal varicosities, allowing us to understand the mechanisms governing varicosity formation and heterogeneous protein composition. This system represents a novel means to evaluate the effects of compression and shear stress on different subcellular compartments of neurons, different from other in vitro systems that mainly focus on the effect of stretching. Importantly, owing to the unique features of our system, we recently made a novel discovery showing that the application of pressurized fluid can rapidly and reversibly induce axonal varicosities through the activation of a transient receptor potential channel. Our biomechanical system can be utilized conveniently in combination with drug perfusion, live cell imaging, calcium imaging, and patch clamp recording. Therefore, this method can be adopted for studying mechanosensitive ion channels, axonal transport regulation, axonal cytoskeleton dynamics, calcium signaling, and morphological changes related to traumatic brain injury.

This protocol describes a physiologically relevant, pressurized fluid approach for rapid and reversible induction of varicosities in neurons.

Un système de Microbiomechanical pour l’étude de la Formation de varicosité et récupération dans les axones des neurones centraux

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...