Le mécanisme associé à la phagocytose dans l’infection à Leishmania reste mal compris. Nous décrivons ici des méthodes pour évaluer les premiers états de durcissement au cours de l’interaction de Leishmania avec les cellules hôtes. Cette technique présente comme le principal avantage, permettant l’étude des différents états de phagocytose de Leishmania et la participation de plusieurs protéines.
Il convient de noter que cette technique peut également être étendue à d’autres types d’études, y compris l’infection par des bactéries, des levures ou l’engloutissement par d’autres types de cellules. Les personnes qui essaient cette technique devraient prendre soin du temps d’exposition des cellules à la solution de Nucleofector. De plus, nous suggérons de commencer à tester la transfection en utilisant un maximum de deux plasmides.
La démonstration de la procédure sera Amanda Reboucas, une doctorante de notre laboratoire. Pour commencer, ensemencez 0,2 million de cellules THP-1, ou macrophages dérivés de monocytes humains dans 500 microlitres RPMI par puits sur une plaque de 24 puits avec des lamelles de verre de 13 millimètres. Incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone, laver les cellules deux fois avec 0,9% de solution saline et incuber les cellules dans un milieu RPMI complet.
Ajouter la phase stationnaire des espèces de Leishmania aux cellules à un parasite 10 est à un rapport de cellule hôte, puis centrifuger à 720 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir incubé les cellules à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes, lavez les cellules deux fois avec une solution saline à 0,9% pour éliminer tous les promastigotes non internalisés. Incuber les cellules dans un milieu RPMI supplémenté à 37 degrés Celsius pendant une heure, puis fixer les cellules avec 4% PFA pendant 15 minutes.
Ensuite, montez les lamelles de recouvrement à l’aide du support de montage préféré. Ensuite, comptez au moins 400 cellules dans des champs aléatoires sous un microscope à fluorescence. Pour étudier la biogenèse PV induite par Leishmania, commencez à transfecter les cellules THP-1 avec du plasmide en ensemençant 15 millions de cellules THP-1 dans des flacons de culture tissulaire de 75 centimètres carrés contenant 10 millilitres de milieu RPMI complet complété par 100 nanogrammes par millilitre de PMA et 50 micromolaires au mercaptoéthanol pendant 48 heures.
Ensuite, lavez les cellules une fois dans une solution saline à 0,9% et détachez les cellules à l’aide d’une solution de dissociation cellulaire non enzymatique. Ensuite, centrifuger à 250 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, remettez en suspension les cellules THP-1 dans un millilitre de milieu RPMI et effectuez des comptages dans une chambre de Neubauer.
Centrifuger à nouveau les cellules à 250 fois g pendant 10 minutes à température ambiante et jeter le surnageant. Resuspendre 2 millions de cellules dans 100 microlitres de solution de Nucleofector et incuber avec 0,5 microgramme du revêtement plasmidique de la protéine d’intérêt, marquée avec une protéine fluorescente. Transférer la suspension contenant des cellules THP-1 et de l’acide nucléique dans la cuvette Nucleofector.
Ensuite, transfectez les cellules à l’aide du programme Nucleofector Y un. Récupérer les cellules transfectées et les ensemencer dans 500 microlitres de milieu RPMI sur 24 plaques de puits avec des lamelles de verre de 13 millimètres. Incuber les cellules et compléter le milieu RPMI à 37 degrés Celsius pendant 0,5, 2, 4, 6, 12 et 24 heures.
Laissez les lamelles de verre de 13 millimètres à température ambiante et protégez-les de la lumière au moins 30 minutes avant l’acquisition. Nettoyez les lamelles de couverture avec un tissu absorbant. Ensuite, ajoutez une goutte d’huile d’immersion à l’objectif, puis ajoutez la diapositive.
Déplacez l’objectif vers le haut jusqu’à ce que l’huile touche la glissière. Observez et ajustez la mise au point sur le microscope et choisissez l’option objectif 63x avec huile. Ouvrez le programme LIQA et ajustez les lasers dans les longueurs d’onde 488, 552 et 405.
Sélectionnez la résolution de l’image 1024 x 1024. Après avoir cliqué sur le bouton en direct, définissez la pile Z et appuyez sur l’option de début. Attendez l’acquisition de l’image, puis sélectionnez l’option, projection maximale, dans les outils.
Enregistrez l’expérience et exportez les images au format TIFF vers un ordinateur. Les résultats ont montré que Leishmania Braziliensis LCL et Leishmania Braziliensis DL se lient de manière similaire aux macrophages. De plus, aucune différence n’a été observée concernant Leishmania Braziliensis LCL et Leishmania Braziliensis DL phagocytose par les cellules hôtes.
Le recrutement de CL3 dans la vacuole parasitophore, ou PV, induite par Leishmania Braziliensis LCL ou Leishmania Braziliensis DL, a été comparé dans des cellules infectées. Après quatre heures d’infection, des pourcentages similaires de PV décorés de CL3 dans les macrophages infectés par Leishmania Braziliensis LCL et Leishmania Braziliensis DL ont été observés. Ainsi, les résultats ont montré que Leishmania Braziliensis LCL et Leishmania Braziliensis DL interagissent de manière similaire avec les macrophages lors de la liaison, de la phagocytose et de la biogenèse des PV concernant le recrutement de la CL3.
Des images microscopiques représentatives ont démontré une transfection efficace des cellules THP-1 avec les plasmides PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP. Les personnes qui essaient ce protocole doivent faire attention à l’incubation de la température et protéger les échantillons de microscope de la lumière, de tous les types. La modulation de l’expression des protéines identifiées précipitant la phagocytose de Leishmania démontrera l’importance de ces protéines dans le résultat de l’infection à Leishmania.
Nous pouvons étendre cette technique à différents types d’études pathologiques et de mécanismes associés à l’établissement de parasites et à l’identification de cibles pour le développement de stratégies thérapeutiques.
