L’importance de ce protocole est qu’il introduit une technique d’imagerie sans étiquette capable d’acquérir des images à contraste élevé à des taux d’images élevés qui est plus simple et moins cher que d’autres techniques comme le DIC et le champ sombre. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est facile à mettre en œuvre et qu’elle est facile à utiliser. Il est peu coûteux et il peut être combiné avec des microscopes à fluorescence facilement.
La méthode a été développée pour visualiser les microtubules individuels. Il a le potentiel d’être utilisé pour visualiser les grands complexes protéiques et les nanoparticules. La principale difficulté est l’énergie d’activation nécessaire pour bricoler avec le cube de filtre pour ajouter le miroir demi-argent.
Mon conseil à quelqu’un qui essaie la technique pour la première fois est juste de le faire. Pour commencer, insérez un miroir 50/50 dans la roue filtrante d’un microscope fluorescent à l’aide d’un cube de filtre approprié. Manipulez le miroir avec soin car souvent ils ont un codage anti-réflexion.
Tournez-vous vers un objectif de grossissement élevé qui a également une ouverture numérique élevée. Celui montré ici est un objectif de pétrole 100x avec une ouverture numérique de 1,3. Ensuite, utilisez une lame de rasoir et une lame de microscope comme bord droit pour couper trois millimètres de large bandes de film de paraffine en plastique.
Placez deux des bandes de film en plastique de paraffine trois millimètres l’une de l’autre sur un glissement propre de couverture de 22 par 22 millimètres, puis placez un glissement de couverture de 18 par 18 millimètres sur le dessus des bandes pour former un canal. Transférer le glissement de couverture dans un bloc thermique à 100 degrés Celsius pendant 10 à 30 secondes pour que le film de paraffine forme un canal scellé. À l’aide d’une pipette, couler dans 50 microgrammes par millilitre d’un anticorps anti-rhodamine par perfusion et incuber la lame pendant 10 minutes.
Après l’incubation, laver le canal cinq fois à l’aide de BRB80 filtré, puis couler dans 1%Poloxamer 407 dans le BRB80 filtré pour bloquer la surface contre la liaison non spécifique et incuber la diapositive pendant 10 minutes. Encore une fois, lavez le canal cinq fois à l’aide de BRB80 filtré. Pour éviter que l’échantillon ne se dessèche, ajoutez deux gouttelettes du BRB80 filtré aux extrémités du chenal et ajoutez plus de tampon au besoin.
Placez l’échantillon au stade du microscope et allumez la source de lumière épi-illumination. Concentrez-vous sur le bord du film de paraffine pour trouver la surface de l’échantillon, puis déplacez le champ pour régler la vue vers le centre de la chambre. Vous observerez plusieurs surfaces au fur et à mesure que l’objectif est déplacé vers le haut et vers le bas en raison de la réflexion arrière de la lumière de l’optique dans le chemin optique.
Ensuite, centrez le diaphragme de champ dans le champ de vision en le fermant à mi-chemin et en utilisant les vis d’ajustement. Une fois que le diaphragme est correctement aligné, ré-ouvrez-le. Puis, glissez dans l’objectif Bertrand pour voir le plan focal arrière, également connu sous le nom de pupille de sortie de l’objectif.
Fermez le diaphragme d’ouverture au-delà des bords de la pupille de sortie et utilisez les vis de réglage pour centrer le diaphragme d’ouverture par rapport à la pupille de sortie. Vérifiez en ouvrant le diaphragme d’ouverture et en faisant correspondre ses bords avec ceux de la pupille de sortie. Ensuite, réglez le diaphragme d’ouverture à environ les deux tiers de l’ouverture numérique de l’objectif.
Pour commencer, réglez le temps d’exposition de la caméra à 10 millisecondes et ajustez l’éclairage pour presque saturer la plage dynamique de la caméra. Ensuite, utilisez une pipette pour couler dans 10 microlitres de microtubules stabilisés gmpcpp dans 0,22 micromètre filtré BRB80. Surveillez la liaison microtubule sur l’imagerie de la surface.
Une fois que 10 à 20 microtubules sont liés dans le champ de vision, lavez l’échantillon deux fois avec le BRB80 filtré. Acquérir 10 images des microtubules en mettant en place un laps de temps avec une exposition de 10 millisecondes et une période de retard d’une seconde pour un total de 10 secondes. Ensuite, acquérez des images de fond en déplaçant la scène à l’aide du contrôleur de scène le long du long axe du canal tout en acquérant 100 images sans délai.
Pour imager la dynamique des microtubules à l’aide d’une tubuline cérébrale, commencez par fixer la température du réchauffeur de l’échantillon à 37 degrés Celsius. À l’aide d’une pipette, coulez dans 10 microlitres de graines de microtubules stabilisées par GMPCPP et surveillez-les en les liant à la surface en imagerie de la surface en direct. Une fois que 10 à 20 graines sont liées dans le champ de vision, lavez l’échantillon en utilisant deux fois le volume du canal de BRB80 préchauffé et filtré.
Ensuite, l’écoulement dans 10 microlitres du mélange de polymérisation. Pour mesurer la croissance des microtubules, configurez un laps de temps à l’aide du logiciel d’acquisition pour acquérir une image toutes les cinq secondes pendant 15 minutes. Améliorez le contraste en acquérant une image moyenne de 10 à chaque point de temps.
Acquérir des images d’arrière-plan comme indiqué dans la section précédente. Calculez la médiane en allant à l’image, en sélectionnant la pile, puis le projet Z, puis la médiane. Soustrayez l’arrière-plan correspondant en allant traiter, en allant à la calculatrice d’image, et en choisissant de soustraire du menu dropdown.
Assurez-vous que l’option de résultat du flotteur 32 bits est vérifiée. Pour le retrait des microtubules, acquérir des images à 100 images par seconde en fixant le délai à zéro et en maintenant le temps d’exposition à 10 millisecondes. Un facteur important pour l’acquisition d’images à contraste élevé avec la microscopie d’induction d’interférence est de bien définir l’ouverture numérique de l’éclairage.
Cela peut être fait en guidant la taille du faisceau d’éclairage à la pupille de sortie de l’objectif, qui est contrôlé par la taille du diaphragme d’ouverture. À l’aide d’un échantillon de microtubules stabilisés étiquetés florescently, mettre les microtubules au point à l’aide du bouton de focalisation du microscope tout en les imagerie fluorescente. Réglez l’exposition de la caméra à 10 millisecondes et fermez le diaphragme d’ouverture à sa plus petite ouverture.
En outre, ajustez l’éclairage pour presque saturer la plage dynamique de la caméra ou jusqu’à ce que le maximum soit atteint. Acquérir 10 images en streaming d’un champ de vision contenant 10 microtubules ou plus. Puis acquérir une image de fond.
Modifiez la taille du diaphragme et ajustez l’intensité de l’éclairage pour correspondre à celle qui était précédemment déterminée. Acquérir 10 nouvelles images et un nouveau fond. Répétez ce processus jusqu’à ce que toute la portée du diaphragme soit terminée.
Pour chaque champ de vision acquis, soustrayez l’arrière-plan correspondant et la moyenne de l’arrière-plan résultant des images soustraites comme indiqué précédemment. Ensuite, calculez le rapport moyen signal/bruit de fond des microtubules pour chaque taille d’ouverture. Réglez la taille du diaphragme à celle qui produit le rapport signal/bruit de fond le plus élevé.
Il est possible qu’il existe une gamme de tailles qui produisent un contraste comparable comme indiqué ici. Avec un microscope bien aligné, les microtubules doivent être visibles sans soustraction de fond. La soustractation de l’arrière-plan, cependant, améliore le contraste du microtubule.
Pour améliorer encore le contraste, la moyenne, le filtrage 4a, ou une combinaison des deux peuvent être utilisés. Les analyses en ligne présentées ici décrivent l’amélioration progressive de la qualité de l’image. Ceux-ci décrivent une réduction notable du bruit de fond à chaque étape de traitement.
La dynamique des microtubules peut être rapportée dans les kinographes, qui sont générés à partir de films en accéléré. Un exemple de kinographe acquis à une vitesse d’image de 0,2 image par seconde est montré ici. Les lignes pointillées marquent les graines.
Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de travailler avec des objectifs d’ouverture numérique élevés. Il est également important d’aligner et de définir correctement la taille du cadre de diamètre de l’ouverture. Il est facile de combiner IRM et imagerie par fluorescence pour étudier, par exemple, les protéines liant les microtubules et la façon dont elles modifient la dynamique des microtubules.
La technique réduit considérablement les dommages causés par la photo et permet une acquisition plus élevée du taux d’image, ce qui facilite l’étude des biopolymères étiquetés tels que les microtubules pendant de longues périodes de temps avec une résolution temporelle élevée et une bonne précision de suivi.
