1. Course sur tapis roulant pour avoir révélé l&#39;étendue des blessures musculaires dans des modèles murins <ol><li> Établir l&#39;angle de la surface de tapis roulant pour une utilisation au cours du protocole en cours. Généralement, un niveau plat ou un angle compris entre 7 ° et 15 ° degrés en descente ou en montée est utilisé. Certains tapis roulants ont dans l&#39;appareil intégrante de régler l&#39;inclinaison tandis que d&#39;autres nécessitent le tapis roulant pour être élevés par d&#39;autres moyens. </li><li> Placez un bac ou un tampon de laboratoire bleue sous le tapis roulant avant de mettre les animaux dans le tapis roulant pour recueillir tous les déchets des animaux pendant le protocole de fonctionnement. </li><li> Avant de souris qui doivent être acclimatés à l&#39;environnement du tapis roulant. Il s&#39;agit de placer les animaux dans le tapis roulant pendant 15 minutes avec le réseau électrique hors tension et le moteur d&#39;entraînement par courroie sur la ceinture, mais ne bouge pas (c&#39;est à dire avec la vitesse à 0 m / s). </li><li> Tournez sur la grille de motivation électrique. L&#39;intensité et la fréquence des impulsions utilisées peuvent généralement être contrôlés sur des tapis roulants, mais varie d&#39;un fabricant à l&#39;autre. Généralement, l&#39;intensité maximale n&#39;est pas nécessaire de motiver les souris de courir tout une fréquence élevée (au moins une fois toutes les deux secondes) permettra d&#39;améliorer la conformité. </li><li> Activer la ceinture de tapis roulant pour commencer le protocole en cours. Une vitesse initiale d&#39;environ 5 mètres / min devrait être utilisé pour une période d&#39;échauffement pour les souris. La vitesse du tapis roulant peut être accéléré lentement, généralement en ajoutant 1-2 mètres / min pour chaque minute suivant le début du tapis roulant. </li><li> Respect des animaux dans la plupart des protocoles peuvent être améliorés par la réalisation d&#39;une série de courts tirages (5 minutes) à la vitesse d&#39;échauffement de 3 à 10 jours avant la course commence expérimentale. </li><li> Un exercice d&#39;épuisement aiguë implique généralement d&#39;augmenter la vitesse du tapis roulant avec le temps jusqu&#39;à une vitesse maximale (généralement &lt;30 m / m) est atteint et maintenu jusqu&#39;à ce que la souris montrent des signes d&#39;épuisement. Critères pour juger de l&#39;épuisement varient, mais comprennent généralement une souris dépenser plus que la moitié du temps sur le réseau électrique ou 5 secondes consécutives sur le réseau électrique sans revenir à la surface du tapis roulant. Après une souris individuelle est épuisé, il peut être enlevé du tapis roulant et le temps total de course peuvent être enregistrées. </li><li> Changement de l&#39;angle du tapis roulant peut être utilisé dans des essais en marche aiguë d&#39;augmenter la charge d&#39;exercice (avec un angle vers le haut) ou pour induire endommager les contractions excentriques (avec une descente d&#39;angle) qui déchirent les membranes de 1 sarcolemme des fibres musculaires. Bleu Evans peut être injecté dans des animaux avant de telles procédures pour une utilisation comme colorant histologique d&#39;identifier les fibres musculaires endommagées 2,3. </li><li> L&#39;entraînement en endurance courir protocoles fournissent une charge d&#39;exercice à l&#39;animal au cours d&#39;une période de temps prolongée (jusqu&#39;à mois) afin de produire de remodelage du muscle ou du système cardiovasculaire. Warm up procédure est la même que ci-dessus (étape 1.5), cependant la vitesse maximale est généralement plus faible et le temps de fonctionnement peut être assez long (&gt; 1 heure). </li><li> Après achèvement de courir les souris peuvent être retournés dans leur cage. Tapis de course deviennent habituellement très sale tandis que les souris sont en cours, notamment sur les protocoles longs. Il est nécessaire de nettoyer le tapis roulant, généralement avec un spray d&#39;éthanol à 70%, après chaque utilisation. </li></ol> 2. Ex Vivo dosage de la capacité de réparation de la membrane des fibres musculaires isolés après UV-laser Dommages <ol><li> Disséquer la couche superficielle de la court fléchisseur des orteils (FDB) du muscle du pied de la souris. D&#39;abord, couper la peau de l&#39;ouverture exclusive à la ligne médiane en prenant soin de ne pas endommager le muscle en dessous, puis faire des coupes horizontales et enlever la peau. Le tendon du muscle plat blanc FDB (tendon proximal) peut être vu attaché à l&#39;os calcanéum. Carrément séparée du tendon par forceps et de rompre la clôture tendon de site de fixation, prenez le tendon libre par des pinces et tirez doucement jusqu&#39;à séparer les FDB à partir des tissus environnants tout en réduisant les tissus conjonctifs qui restent attachés. En voyant la branche distale des tendons aux chiffres individuels du FDB peut être enlevée par une coupe où ces tendons se connecter à la couche profonde du muscle. </li><li> Mettez le faisceau musculaire FDB dans 1 ml de solution de collagénase pré-chauffé à 37 ° C dans un tube Eppendorf de 1,5 ml, coller le tube dans une orientation horizontale dans un 37 ° C agitateur orbital et serrer à 200 rpm pendant 65 min. Les temps d&#39;incubation peut être ajustée pour assurer une digestion suffisante, ce qui est indiqué par une apparence effiloché et la couleur pâle du muscle. </li><li> Transférer soigneusement le faisceau FDB digérés dans un tube de centrifugeuse 1,5 ul contenant ~ 600 ul de 2,5 Ca 2 + via Tyrode un bout de 1 ml avec une pipette bout coupé qui a un diamètre suffisant pour permettre à l&#39;ensemble digérée facilement passer à travers sans interruption. Délicatement retourner le tube pour secouer les fibres lâches du faisceau. </li><li> Couper une pointe de pipette 30 uL de sorte que le diameter n&#39;est que légèrement plus petit que le faisceau musculaire (entre 15 - 20 m de diamètre) Utiliser la pipette à la tire doucement le faisceau dans la pipette et ensuite le repousser dans la solution.. Répétez ce processus jusqu&#39;à ce que la majorité des fibres sont dissociées de l&#39;ensemble. </li><li> Mélangez bien par des fibres dissociées tournant doucement le tube, prenez la quantité désirée et déposez-le sur un plat à fond de verre delta T. Le volume de chargement varie en fonction de l&#39;efficacité de l&#39;isolement et le nombre de fibres utiles qui sont nécessaires sur un plat pour un protocole particulier. Les fibres restantes peuvent être stockés dans le tube à 4 ° C pendant environ 6 heures pour des études supplémentaires. </li><li> Laisser le plat tranquille pendant 5 minutes. Ceci permet aux fibres d&#39;adhérer au fond de verre de la vaisselle. </li><li> Placer le plat à fond de verre sur un microscope confocal équipé d&#39;un laser UV. Observez les fibres sous microscopie de phase à un grossissement&gt; 100X pour vérifier la présence d&#39;un motif de stries normales et une droite, tige comme la forme. </li><li> Ajouter FM1-43 ou FM4-64 colorants styrylpyridinium 4 à la solution à une concentration finale de 2,5 uM 5. </li><li> Pour induire des dommages à la position de la fibre dans la fenêtre d&#39;imagerie afin que la fibre est orientée à un angle de 45 ° à partir du haut à gauche du champ de vue en bas à droite (figure 1). Irradier une zone de pixels 5x5 (environ 0.9μmx0.9μm) de la membrane plasmique à l&#39;aide d&#39;un laser UV (80 MW ou plus, 351/364 nm) mis à la puissance maximale pendant 5 secondes. La région irradiée doit diviser la membrane plasmique, c&#39;est la moitié de la boîte 5x5 devrait être à l&#39;intérieur de la fibre, tandis que le reste devrait être en dehors de la fibre (figure 1). </li><li> Capture d&#39;images d&#39;entrée colorant dans la fibre à des intervalles de 5 secondes chacun pour un maximum de 5 minutes. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.8 pour pas plus de 3 fibres par plat, comme le colorant fluorescent sera finalement endocytosée dans la fibre et compliquer toute analyse des données. Après 3 fibres d&#39;un nouveau plat doit être préparé à l&#39;étape 2.5. </li><li> Analyser les données en calculant la variation d&#39;intensité de fluorescence (AF / F 0) entre chaque image capturée pour mesurer la quantité d&#39;entrée colorant. Ceci nécessite la mesure de la moyenne de fluorescence d&#39;une zone d&#39;environ 200 um 2 en utilisant des logiciels d&#39;analyse comme la disposition du public ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). A titre de comparaison entre les fibres, le calcul suivant doit être faite pour chaque image: AF / F 0, où F 0 est la moyenne de fluorescence de la région d&#39;intérêt dans la première image capturée (t = 0; avant l&#39;accident), et Af est le changement de fluorescence de chaque trame suivante (FF 0). </li></ol> 3. En direct d&#39;imagerie cellulaire confocale de surveiller le processus dynamique de réparation de la membrane cellulaire <ol><li> Micropipettes ont été fabriqués à partir de PYREX capillaires. Le capillaire est placé sur un extracteur micropipette et tiré par le programme préétabli (chaleur = 695; Tirez = 50; Vel .= 55; Temps = 250). </li><li> Micropipette était attaché à un 3 axes (xyz) micromanipulateur. </li><li> Les cellules sont transfectées avec l&#39;ADN plasmidique en utilisant des méthodes normales sur un fond de verre plat du delta T. Les médias devraient être mis à 2.5mm Ca 2 + du tampon de Tyrode avant les expériences commencent. </li><li> Plats en verre contenant des cellules transfectées ont été placés sur un microscope confocal à balayage laser, avec l&#39;objectif 40X huile d&#39;immersion 1.3NA. </li><li> Le aiguë des cellules vivantes dommages a été réalisée en insérant la micropipette dans la membrane cellulaire et ensuite rentrer rapidement la micropipette hors de la cellule 3,6. Consécutive images de cellules vivantes ont été obtenus à un intervalle de 1,54 s / châssis. </li><li> Pour le dosage de la saponine membrane induite des perturbations, la saponine 0,005% (Sigma) dans 2,5 mM de Ca 2 + Tyrode tampon a été perfusé par un système à écoulement gravitaire perfusion personnalisé assemblé 7. Le débit de perfusion est d&#39;environ 1 ml / min et la pointe de perfusion doit être placé directement au-dessus de la cellule étant imagé. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Un film représentatif de la souris le tapis roulant peut être fait pendant le tournage. Le film va illustrer la capacité réduite de fonctionnement du MG53-/ - ont raison de dommages au muscle squelettique. L&#39;étendue des dégâts causés par le protocole de dommages des rayons UV-laser détaillées ci-dessus dépend de la capacité de réparation de la membrane de la fibre analysés. Cette capacité est affectée par le génotype de la souris à partir de laquelle la fibre a été isolé, les conditions extracellulaires, et toute modification de l&#39;expression des protéines (transfection ou infection). Une fibre de type sauvage normal permettra légère à modérée d&#39;entrée colorant (figure 2a). Fibres musculaires provenant du MG53-/ - ont une capacité de membrane de réparation compromise affichera entrée plus importante de colorant dans la fibre (Figure 2b). Les résultats typiques pour la translocation montrent microélectrode blessure de MG53 contenant vesicles à l&#39;endroit de la blessure. Figure 3a et 3b montrent GFP-MG53 myotubes C2C12 transfectées endommagé par l&#39;insertion de la micropipette dans la membrane cellulaire. Dans la cellule avant que des dommages micropipette, GFP-MG53 est situé sur les deux membrane plasmique et le cytoplasme 3. Après la pénétration micropipette, GFP-MG53 vésicules contenant déplacé vers des sites dégâts (comme indiqué par une flèche). La figure 3c montre une GFP-MG53 transfectées C2C12 myoblastes traités avec 0,005% de la saponine, un détergent qui peut perméabiliser la membrane plasmique. Lors du traitement de saponine, GFP-MG53 transloqué du cytosol vers la membrane cellulaire. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Weisleder, et al. Figure 1. L&#39;alignement des fibres et de définition de région blessure. Une orientation correcte de la fibre musculaire isolée au sein du champ de vision et la définition de la région de blessures indiqué. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Weisleder, et al. Figure 2. Dommage laser UV de FDB fibre. Les images montrent des fibres avant de blessures (0 sec, à gauche) et à 200 sec après la lésion (à droite). Fibres d&#39;une souris de type sauvage (a) montrent des blessures légères. Fibres de souris avec la réparation de la membrane compromise (b) permettre à plus de colorant pour entrer. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Weisleder, et al. Figure 3. Dommages de microélectrodes et de saponine à des cellules cultivées. Les images montrent myotubes C2C12 (a, b) et un myoblastes C2C12 (c) avant l&#39;accident (en haut) et après la lésion (en bas). Cellules blessé avec une microélectrode (a, b) montrent MG53 translocation vers les sites des blessures (flèches). Les cellules traitées avec de la saponine (c) montrent MG53 translocation vers la membrane cellulaire.

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Le tapis roulant est une méthodologie utile à fournir une charge d&#39;exercice pour les animaux traités. Comme une méthodologie pour mesurer la fonction musculaire ou la capacité d&#39;endurance, il s&#39;agit d&#39;une approche notoirement bruyants qui est difficile à exécuter d&#39;une manière reproductible 8. En général, les temps d&#39;épuisement peut être utilisé comme un point final pour résoudre les différences majeures entre les groupes expérimentaux, comme ceux entre certaines lignées de souris knock-out et des souris de type sauvage 9. Les manipulations expérimentales qui produisent différence plus subtile, comme certains essais pharmaceutiques, ne peuvent pas résoudre les différences au-dessus du bruit associé à cette technique. Afin de maximiser la reproductibilité et la sensibilité de ces techniques, il est important de maintenir les conditions d&#39;une session à de très près. L&#39;heure de la journée, les animaux sont exercés, ainsi que les conditions chaudes période allant utilisées, sont des facteurs importants et devraient rester cohérentes d&#39;un essai à. Effets de déformation peuvent avoir un impact significatif sur la conception de protocoles de tapis roulant que certaines souches de souris peut fonctionner pendant beaucoup plus de temps sur le tapis roulant que les autres souches et réagissent différemment à un exercice d&#39;endurance 10. En règle générale, beaucoup de souris sera capable d&#39;exécuter 200-300 mètres au total dans une étude de l&#39;épuisement avec une augmentation constante de la vitesse du tapis roulant (5 m / m vitesse initiale de 1 m / m ajoutée pour chaque minute après le démarrage). Pour un exercice d&#39;endurance des souris peuvent être effectués entre 9 à 12 m / m pendant 30 minutes 2 ou 3 fois par semaine. Cependant, des études individuelles nécessitent habituellement une optimisation du protocole pour correspondre à des besoins individuels expérimental. La procédure de dommages des rayons UV-laser a été montré pour être une méthode efficace pour mesurer la capacité de réparation de la membrane des fibres musculaires squelettiques 3,6,11. Une composante essentielle à la réussite de ces expériences est d&#39;utiliser des fibres musculaires qui affichent une seule droite, l&#39;aspect en forme de tige avec un motif régulier de stries et d&#39;un sarcolemme lisse qui ne semble pas froissé. Si d&#39;autres fibres musculaires sont sélectionnés endommager les membranes peuvent être déjà présents dans ces fibres et l&#39;interprétation des résultats de ces expériences peuvent être compliquées. Il est aussi important que l&#39;orientation de la fibre et la définition de la région irradiée être tel que défini dans la figure 1. Cette offre d&#39;une blessure de la taille reproductibles, permettant ainsi la comparaison entre les fibres. Si la région définie de blessure se situe complètement dans la fibre, une blessure interne sera créée, plutôt que de perturber le sarcolemme. En outre, la valeur calculée pour AF / F 0 est très sensible à la région d&#39;intérêt choisie pour la mesure de la fluorescence moyenne. Une zone d&#39;environ 200μm 2, adjacente et y compris le site de la lésion, est appropriée. Contrairement à la région définie par une blessure, cette zone devrait se situer complètement à l&#39;intérieur de la fibre. Si vous incluez un espace extérieur de la fibre, la région va augmenter entraînant vierge AF / F 0 en fibres avec une entrée de teinture peu tout en réduisant AF / F 0 en fibres avec un phénotype plus sévère. Cela diminue la sensibilité de l&#39;essai, ce qui rend la comparaison entre les fibres plus difficile. Pour le dosage de dommages micropipette, l&#39;angle entre la micropipette et le plat à fond de verre devrait être d&#39;environ 45 degrés afin de bien endommager la membrane cellulaire. Les cellules ont été choisis pour les dommages micropipette devrait être étroitement attaché au fond du plat et des cellules arrondies ne doit pas être utilisé car ils seront très probablement se détacher après micropipette piquer. Expériences permeabilzation saponine sont techniquement moins exigeant et relativement plus rapide pour effectuer des tests par rapport à micropipette pénétration. Cependant, il existe plusieurs limites à la saponine dommages, y compris celle d&#39;une seule cellule peut être utilisé par plat, depuis la saponine se diffuse et des lésions d&#39;autres cellules dans ce plat.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Tapis roulant rongeurs </td><td> Columbus Instruments Exer 3 / 6 ou équivalent </td><td></td></tr><tr><td> 70% d&#39;éthanol </td><td> ISC Bioexpress </td><td></td></tr><tr><td> Des outils de dissection, y compris une pince fine pointe, des ciseaux à ressort </td><td> Instruments de précision du monde </td><td></td></tr><tr><td> 2 collagénase de type mg / ml, je </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> Ca 2 + 0 Tyrode tampon (140 mM NaCl, 5 mM de KCl, 10 mM d&#39;HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7,2, 290 mosm) </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> 2,5 mM de Ca 2 + Tyrode tampon (NaCl 140 mM, 2,5 mM CaCl 2, 5 mM de KCl, 10 mM HEPES, MgCl2 2 mM, pH 7,2, 290 mosm) </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> Température contrôlables agitateur orbital </td><td> Nouveau-Brunswick ou équivalent </td><td></td></tr><tr><td> Delta TPG vaisselle </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1207133 </td></tr><tr><td> LSM 510 microscope confocal avec un laser UV Enterprise 80 mW ou équivalent microscope confocal </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> FM1-43 ou FM4-64 colorants </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicate Capillaires Taille 0.8 à 1.0 X 100 mm </td><td> PYREX </td><td> N ° 9530-2 Partie </td></tr><tr><td> Micropipette extracteur </td><td> Sutter Instruments </td><td> modèle P-97 </td></tr><tr><td> 3 axes micromanipulateur </td><td> Narishige </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> Radiance 2100 microscope confocal à balayage laser ou un microscope équivalente </td><td> BioRad </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> La saponine </td><td> Sigma </td><td> 47036 </td></tr></tbody></table>

visualization of mg53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems

Réparation de lésion aiguë de la membrane cellulaire est un processus élémentaire de physiologie cellulaire normale et réparation de la membrane défectueuse a été lié à de nombreuses maladies dégénératives humaines. La découverte récente de MG53 comme un élément clé de la machinerie rescellage membrane permet une meilleure compréhension moléculaire de la biologie de base de réparation des tissus, ainsi que pour les applications potentielles translationnelle en médecine régénérative. Ici, nous détaillons les protocoles expérimentaux pour explorer la fonction in vivo de MG53 dans la réparation des blessures musculaires en utilisant des protocoles d&#39;exercice sur tapis roulant sur ​​des modèles de souris, pour tester la capacité de la membrane ex vivo par la mesure de réparation de l&#39;entrée du colorant dans les fibres musculaires isolées, et pour le suivi du processus dynamique du trafic vésiculaire MG53-médiation et de réparation dans la membrane cellulaire des cellules cultivées en utilisant la microscopie confocale de cellules vivantes.

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Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Décrites ici sont des protocoles utilisés pour visualiser le processus dynamique de MG53 médiation réparation de la membrane cellulaire chez les animaux entiers et au niveau cellulaire. Ces méthodes peuvent être appliquées pour étudier la biologie cellulaire de refermeture membrane plasmique et la médecine régénérative.

Visualisation de MG53 médiation réparation de la membrane cellulaire utilisant In vivo Et In vitro Systèmes

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

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Biology

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

12.3K vues.  Robert Wood Johnson Medical School. Décrites ici sont des protocoles utilisés pour visualiser le processus dynamique de MG53 médiation réparation de la membrane cellulaire chez les animaux entiers et au niveau cellulaire. Ces méthodes peuvent être appliquées pour étudier la biologie cellulaire de refermeture membrane plasmique et la médecine régénérative.

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Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Utiliser Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) pour développer des outils diagnostiques

Recherche

Biologie

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Vidéo analyse bioinformatique des droits de croissance de la tige colonie de cellules embryonnaires

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Analyse de Schwann-astrocytes interactions à l&#39;aide In Vitro Tests

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

Essai de superposition des protéines membranaires: Un protocole pour tester l&#39;interaction entre les protéines solubles et insolubles In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

Imagerie de la membrane cellulaire des blessures et des processus sous-cellulaires impliquées dans la réparation

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes precursor mRNA beyond the end of mature RNAs, and an active process of endonuclease activity is required at a specific site. Cleavage of the precursor RNA normally occurs 10-30 nt downstream from the consensus polyA site (AAUAAA) after the CA dinucleotides. Proteins from the cleavage complex, a multifactorial protein complex of approximately 800 kDa, accomplish this specific nuclease activity. Specific RNA sequences upstream and downstream of the polyA site control the recruitment of the cleavage complex. Immediately after cleavage, pre-mRNAs are polyadenylated by the polyA polymerase (PAP) to produce mature stable RNA messages.
Processing of the 3&#8217; end of an RNA transcript may be studied using cellular nuclear extracts with specific radiolabeled RNA substrates. In sum, a long 32P-labeled uncleaved precursor RNA is incubated with nuclear extracts in vitro, and cleavage is assessed by gel electrophoresis and autoradiography. When proper cleavage occurs, a shorter 5&#8217; cleaved product is detected and quantified. Here, we describe the cleavage assay in detail using, as an example, the 3&#8217; end processing of HIV-1 mRNAs.

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3&#039; End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

RNA polymerase II synthesizes a precursor RNA that extends beyond the 3' end of the mature mRNA. The end of the mature RNA is generated cotranscriptionally, at a site dictated by RNA sequences, via the endonuclease activity of the cleavage complex. Here, we detail the method to study cleavage reactions in vitro.

Analyse des réactions de transformation de l&#39;ARN utilisant des cellules des systèmes gratuits: 3 &#39;Fin de clivage de pré-ARNm substrats<em&gt; In vitro</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Mesure de la rigidité de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Souris aortes Utiliser Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

In Vitro et In Vivo des approches pour déterminer la perméabilité des cellules épithéliales intestinales

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.