Name: Vidéo: Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth
Uploaded: 2010-05-20T17:00:00

Le développement de cette méthode a été rendue possible par un financement de la Californie concernant le tabac Programme de recherche sur les maladies, le California Institute for Regenerative, et NSF IGERT subvention sur Vidéo Bioinformatique (# 0903667) à l&#39;UCR ( <a href="http://www.cris.ucr.edu/IGERT/index.php">http://www.cris.ucr .edu / IGERT / index.php</a> ). Sabrina Lin est soutenu par une bourse de thèse de la division supérieure, Shawn Forteno est soutenu par une bourse du NIH MARC, et Shruthi Satish est soutenu par une bourse de la Division des études supérieures. Nous sommes reconnaissants à Anna Trtchounian pour son aide la préparation des figures. Nous remercions également Sam Alworth et Ned Jastromb pour nous enseigner comment utiliser le logiciel CL-Quant.

Partie 1: Procédure expérimentale Les données vidéo contiennent une abondance d&#39;informations. Toutefois, cette information est souvent difficile d&#39;extraire et quand fait manuellement par des humains et peuvent nécessiter de nombreuses heures de temps du personnel à remplir. L&#39;analyse manuelle par l&#39;homme est également soumis à des variations dans l&#39;interprétation et l&#39;erreur. Vidéo bioinformatique implique l&#39;utilisation d&#39;un logiciel informatique pour la mine de données spécifiques à partir d&#39;images vidéo. Cette méthode d&#39;analyse est rapide et permet d&#39;éliminer l&#39;erreur qui survient lorsque l&#39;analyse se fait manuellement par des humains. Le but de cet article est de démontrer une méthode pour quantifier la croissance embryonnaire humaine colonie de cellules souches en utilisant une méthode vidéo bioinformatique. Dans ce papier, des images vidéo en temps écoulé ont été recueillies en utilisant une unité Nikon BioStation d&#39;incubation CT qui permet de multiples champs de cellules à imager au fil du temps (fig. 1). Les méthodes décrites dans ce rapport sont applicables aux données vidéo recueillies par n&#39;importe quelle vidéo microscopiques mis en place. Dans notre modèle expérimental, nous avons plaqué H9 de CSEh dans les plaques de 12 puits de culture tissulaire pendant 48 heures. Durant cet intervalle, les colonies étaient autorisées à fixer et totalement réparties sur Matrigel. Ensuite, les plaques avec des colonies de CSEh attachés ont été transférés au CT BioStation et incubées pendant 48 heures supplémentaires. Alors que dans le BioStation, les images des colonies ont été prélevés à intervalles de 7 minutes et ont ensuite été utilisés pour créer des séquences vidéo time-lapse. Vidéos pour chaque colonie ont ensuite été analysées afin de quantifier la croissance de colonies en utilisant la vidéo recettes bioinformatique développé avec le logiciel CL-Quant. Les analyses effectuées en utilisant des recettes créées avec le logiciel CL-Quant véracité a été vérifiée manuellement à l&#39;aide d&#39;Adobe Photoshop. Partie 2: Préparation des colonies CSEh attachés <ol><li> Cultivez CSEh sur Matrigel revêtement des plaques 6 puits, et une fois 70% de confluence est atteinte, replate un puits de la plaque de 6 puits dans 5 puits d&#39;une de 12 puits plaque enduite de Matrigel comme suit. </li><li> Aspirer moyennes à partir d&#39;un puits contenant des CSEh. </li><li> Rincez bien avec 2x 1ml de PBS. </li><li> Ajouter 1ml de Accutase et incuber pendant 1 minute à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Ajouter 10 à 12 perles de verre dans le puits et agiter la plaque doucement jusqu&#39;à ce que les colonies détacher complètement du fond du puits. </li><li> Neutraliser Accutase utilisant 1ml de mTeSR moyen ou MEF milieu conditionné. </li><li> Centrifuger la suspension de cellules dans un tube 15ml conique à 200g pendant 3 minutes. </li><li> Décanter le surnageant et le culot de rompre avec 500μl de milieu mTeSR frais. </li><li> 100 ul chute de plaques sages de la suspension de CSEh dans chaque puits dans une plaque de 12 puits. </li><li> Plaque de rocher en arrière en douceur et d&#39;observer les cultures sous un microscope optique. Assurez-vous que des amas cellulaires sont répartis uniformément sur la plaque. </li><li> Placez la plaque arrière de 12 puits dans l&#39;incubateur. </li><li> Autoriser CSEh pour attacher et de grandir pendant 48 heures (une durée plus courte peut être utilisée). </li><li> Après 48 heures, décanter les puits de la moyenne et laver avec 500ul de PBS pour enlever les cellules seules. </li><li> Ajouter 1ml de milieu mTeSR à chaque puits. </li><li> Commentaire: Placez immédiatement la plaque dans l&#39;incubateur / microscope pour l&#39;imagerie vidéo. </li><li> Commencer à recueillir des time-lapse images. Essayer de choisir les champs avec discrets colonies isolées qui ne sont pas susceptibles de se transformer en d&#39;autres colonies. </li><li> D&#39;autres méthodes de culture et de la mise en place de CSEh peuvent être utilisées à la place du protocole ci-dessus. </li></ol> Partie 3: Vidéo Bioinformatique CL-Quant logiciel a été utilisé pour créer trois «recettes» qui lorsqu&#39;il est exécuté en séquence va déterminer le nombre de pixels ou de la zone en microns pour chaque colonie au fil du temps. Les trois recettes sont construits dans l&#39;ordre et pour cette application comprennent la segmentation, l&#39;amélioration et de mesure. Analyser la croissance de colonies de CSEh en utilisant le logiciel CL-Quant / développement recette: <ol><li> La recette de segmentation est créé en premier. </li><li> Balayage toute la vidéo pour s&#39;assurer que la vidéo est utilisable. Vérifiez que toute la colonie reste dans le champ de vision et que les autres colonies ne pas entrer sur le terrain. </li><li> Ouvrez l&#39;assistant de segmentation et cliquez sur le bouton &quot;suivant&quot;. </li><li> Sélectionnez le canal d&#39;image correcte (à savoir, la phase, vert, rouge, etc) et cliquez sur le bouton &quot;suivant&quot;. </li><li> Pick &quot;correspondant douce» sur les 3 choix et cliquez sur &quot;suivant&quot;. </li><li> Sélectionnez &quot;veulent&quot; les régions en encerclant les régions sur l&#39;image typique du bord extérieur de la colonie à la zone centrale de la colonie. <ul><li> Cette zone doit être aussi petit que possible, mais doit être représentatif de toute la colonie. </li><li> Lorsque vous utilisez la microscopie à contraste de phase, être sûr d&#39;inclure le halo autour de la colonie pour la sélection de la colonie précise par le logiciel. </li><li> Choisissez une ou deux régions d&#39;intérêt qui peuvent montrer différentesmotifs de pixels dans la colonie, mais ne prenez pas trop de «désirs» qui peut aboutir à l&#39;application masque inexactes. </li></ul></li><li> Cliquez sur le bouton &quot;suivant&quot;. </li><li> Sélectionnez &quot;ne veulent pas« régions en encerclant les régions sur l&#39;image qui ne font pas partie de la colonie et ne fait pas partie de l&#39;arrière-plan. Ce sont les régions qui ont des modèles que vous souhaitez supprimer et inclure des pixels d&#39;artefacts tels que des débris et cellules mortes. Cliquez sur &quot;Suivant&quot;. </li><li> Sélectionnez «de fond», en encerclant les régions que vous souhaitez supprimer. <ul><li> Le &quot;ne veulent pas&quot; et &quot;fond&quot; des régions diffèrent dans ce contexte doit être uniforme et susceptibles d&#39;apparaître dans chaque trame. </li><li> Typiquement, nous sélectionnons le fond gris autour de la colonie. </li></ul></li><li> Cliquez sur le bouton &quot;suivant&quot;. </li><li> Un masque de couleur doit être affiché sur votre région d&#39;intérêt (figure 2A). </li><li> Si le masque ne couvre pas exactement la région d&#39;intérêt, la plage de seuil de segmentation (situé dans le coin en bas à droite de l&#39;écran du logiciel) peut être augmenté ou diminué. </li><li> L&#39;assistant de segmentation invites pour le réglage masque de zone amende supplémentaire si nécessaire. </li><li> Si vous souhaitez modifier votre masque, sélectionnez &quot;Mise à jour molle régions correspondantes&quot;. Cela vous permet de changer le «vouloir», «ne veulent pas», ou «de fond» domaines. </li><li> Si le masque est satisfaisante, sélectionnez &quot;Appliquer seuil et sauver mon masque&quot;, et cliquez sur le bouton &quot;suivant&quot;. </li><li> Le masque sera alors affiché dans une couleur différente. </li><li> Sélectionnez «Terminer». </li><li> La recette doit être affichée dans le coin supérieur droit du logiciel, et il devrait être appelé «recette de segmentation&quot;. </li><li> Renommer la recette si vous le souhaitez en cliquant droit et &quot;renommer&quot;. </li><li> Pour vérifier tache, faites un clic droit et placez la souris sur «appliquer la recette&quot;. </li><li> Un menu apparaîtra qui vous permet de sélectionner le nombre d&#39;images que vous souhaitez utiliser lors de la tache vérifier la recette. Exécuter la recette pour 10 cadres de repérer vérifier l&#39;exactitude du placement de masque. </li><li> Si le masque reprend des pièces de petites régions ou des débris indésirables, vous pouvez créer une &quot;recette amélioration» pour améliorer l&#39;ajustement du masque pour la région d&#39;intérêt. </li><li> Pour créer une recette de mise en valeur, clic droit sur ​​la «recette d&#39;amélioration&quot; du dossier, puis cliquez sur &quot;Nouveau&quot;. Une recette nouvelle amélioration doit être affichée. </li><li> Dans le champ de vue original (FOV), cliquez sur le «renforcement basculer le module&quot; situé à droite de l&#39;image. Passez la souris sur les icônes dans la barre d&#39;outils pour identifier la bonne. </li><li> Sélectionnez &quot;étiquetage&quot; du menu déroulant. </li><li> Sélectionnez &quot;4 étiquetage connecté&quot;. </li><li> Sélectionnez &quot;étiquetage 4 connected2&quot;. </li><li> Une nouvelle barre des tâches doit être affichée. </li><li> Prenez le masque initial (mask0) de la recette de segmentation et de le glisser dans la &quot;saisie&quot; boîte. </li><li> La barre devrait maintenant afficher &quot;masque de saisie #&quot;. </li><li> Faites glisser l&#39;icône avec le &quot;masque de saisie #&quot; pour l&#39;icône du masque 0. </li><li> Trouvez &quot;taille min&quot; dans la barre de tâche et réglez le nombre jusqu&#39;à ce que la région d&#39;intérêt est affiché. Assurez-vous que vous cliquez sur &quot;Exécuter&quot; dans chaque essai de montage. </li><li> Une fois que vous êtes satisfait de votre ajustement de la taille minimale, cliquez sur la «recette d&#39;amélioration» que vous avez créés précédemment. (Figure 2B) </li><li> Au bas de l&#39;écran, sélectionnez &quot;enregistrer la recette&quot;. </li><li> Le logiciel vous invite maintenant à &quot;écraser recette sélectionnée?&quot;, Sélectionnez &quot;oui&quot; </li><li> Vérifiez de façon ponctuelle la recette d&#39;amélioration en utilisant les mêmes procédures que ci-dessus pour la segmentation contrôle ponctuel. </li><li> S&#39;il est satisfait de la segmentation et des recettes accessoires, sélectionnez &quot;Créer un modèle de mesure» sur la barre de droite. </li><li> Renommez le modèle pour si vous le souhaitez. </li><li> Dans la fenêtre de modèle de mesure, de déplacer le curseur sur la figure de cellule cliparts. Maintenez la touche Ctrl enfoncée et sélectionnez la cellule. </li><li> Décochez «paramètre par défaut» et «paramètre de zone de« vérifier sous «morphologie». </li><li> «Modèle» Sortir fenêtre. </li><li> Sélectionnez l&#39;icône créée dans la recette de mesure. </li><li> Renommer la recette. </li><li> Déplacer vers et sélectionnez onglet &quot;Modèle&quot; dans le coin supérieur droit. </li><li> Glissez-déposez votre modèle de mesure précédemment créé dans la fenêtre de mesure. </li><li> Cliquez sur &#39;Oui&#39; pour continuer. </li><li> Dans la fenêtre de la recette de mesure, sélectionnez «Channel mappings», «cellule entière», alors. </li><li> Sélectionnez «Masque mappings». </li><li> Puis &quot;cellule entière&quot; sélectionnez l&#39;option pour le masque amélioré. </li><li> Sélectionnez la &quot;recette de mesure&quot; dans l&#39;onglet recette dans la fenêtre principale. </li><li> Sélectionnez &#39;Enregistrer&#39; icône dans la fenêtre de la recette de mesure. </li><li> Ensuite, fermez la fenêtre. </li><li> Maintenant, fermez et rouvrez le «FOV». </li><li> Faites un clic droit la «recette» icône, «la liste de verrouillage recette&quot; sélectionner et d&#39;exécuter les recettes séquentiellement sur vos données vidéo. </li></ol> Partie 4: Vérification de la précision recette utilisant le logiciel Photoshop Afin de valider la recette créée avec (CL-Quant Softwsont), les mêmes données peuvent être analysées manuellement avec Adobe Photoshop. Pour cette analyse, chaque trame 10ème (chaque point de temps 70 min) a été analysée pour mesurer la taille des colonies de plus de 48 heures. <ol><li> Ouvrez une trame d&#39;une image colonie dans Adobe Photoshop. </li><li> Cliquez sur l&#39;outil Baguette magique dans la barre d&#39;outils. </li><li> Cliquez sur la zone autour de la colonie de sorte que le champ entier est couvert, sauf la région colonie. </li><li> Cliquez sur &quot;Modifier en mode Masque dans la barre d&#39;outils et cliquez sur la colonie de sorte que la colonie est sélectionnée. </li><li> Assurez-vous que la ligne pointillée autour de la colonie s&#39;adapte parfaitement à la périphérie de la colonie et non à l&#39;intérieur. Si la ligne pointillée n&#39;est pas autour de la périphérie, modifiez la valeur de tolérance dans la barre d&#39;outils supérieure en conséquence. </li><li> Allez à la &quot;Fenêtre&quot; du menu déroulant et cliquez sur &quot;Histogramme&quot;. </li><li> Notez la valeur de pixel lorsque le cache = 1. Si le cache est de 2, cliquez sur le &#39;!&#39; de changer de mettre en cache une, puis notez la valeur du pixel. </li><li> Répétez le processus ci-dessus pour chaque trame 10e. Moins de cadres au total peuvent être utilisés si désiré. </li><li> Les données recueillies à l&#39;aide de Photoshop et CL-Quant logiciel peut ensuite être tracée ensemble. Si les recettes CL-Quant êtes véridiques, les courbes pour l&#39;analyse de Photoshop et CL-Quant devrait être très similaire (fig. 3-5). </li><li> Si les recettes élaborées avec CL-Quant êtes véridiques, ils peuvent être appliqués à des données de manière fiable vidéo. </li><li> La valeur en utilisant la vidéo bioinformatique dans cette analyse est qu&#39;une fois que la segmentation, l&#39;amélioration et la mesure des recettes sont élaborés et validés, ils effectuent l&#39;analyse beaucoup plus rapidement et plus précisément d&#39;un humain à l&#39;aide de Photoshop. </li></ol> Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1: Bande de film d&#39;une colonie de CSEh montrant des cadres à différents moments pendant 48 heures de croissance dans un CT BioStation. Cadres ont été prises à intervalles de 7 minutes. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2: (A) Image d&#39;une CSEh avec un masque placé sur la colonie par la recette de la segmentation. Domaines de débris et de fond sont également masqués qui indique que la recette amélioration est nécessaire pour améliorer l&#39;exactitude de l&#39;évaluation. (B) Image de la même colonie, comme indiqué dans &quot;A&quot; après l&#39;amélioration a été réalisée. Le masque sélectionne maintenant que la colonie et le bruit a été éliminée de la sélection. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3: Graphique montrant augmentation de taille des colonies (en pixels) en 48 heures tel que déterminé à l&#39;aide CL-Quant logiciel et Photoshop. Ce graphique trace les données brutes et montre que les colonies commencent à différentes tailles. Il montre également que les deux méthodes de mesure sont en bon accord. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4: Graphique montrant les mêmes données que dans la figure 3 après normalisation pour montrer l&#39;augmentation de taille de la colonie pour cent dans plus de 48 heures. Cela montre que les taux de croissance sont similaires quelle que soit la taille des colonies de départ et que les deux mesures de l&#39;analyse donnent des résultats similaires. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5: Graphique montrant les moyens pour les données normalisées à la figure 4. Ce graphique montre clairement une bonne concordance entre les analyses effectuées en utilisant la vidéo bioinformatique (CL-Quant logiciels) et Photoshop et établit que la recette est véridique. Le léger ralentissement dans la zone pour les données de Photoshop à l&#39;image 325 est due à plusieurs vidéos ne sont pas inclus dans l&#39;analyse de Photoshop.

Vidéo des outils bioinformatiques puissants pour les extraire des données rapidement à partir d&#39;images vidéo. Notre protocole de quantification de la croissance de colonies de CSEh démontre une application de vidéo bioinformatique à un problème biologique. Cette méthode est quantitative et a la particularité intéressante de données révélant des colonies CSEh individuelles. Vidéo recettes bioinformatique peut être développé pour contrôler d&#39;autres processus cellulaires comme la prolifération, ...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>mTeSR1 Human Embryonic Stem Cell Maintenance Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>05850</td>
<td>or any suitable medium for hESC culture.</td>
</tr>
<tr>
<td>BD Matrigel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>356234</td>
<td>or other suitable substrate.</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12 Basal Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11330-032</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Accutase Enzyme Cell Detachment Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>eBioscience</td>
<td>00-4555-56</td>
<td>or other suitable detachment enzyme.</td>
</tr>
<tr>
<td>3mm Glass beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>11-312A</td>
<td>optional.</td>
</tr>
<tr>
<td>12-well Tissue Culture Plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353043</td>
<td>or any other plate format.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nikon BioStation CT/IM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or other incubator/microscope suitable for collecting video data.</td>
</tr>
<tr>
<td>CL-Quant software (Nikon) and/or Photoshop (Adobe).</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

video bioinformatics analysis of human embryonic stem cell colony growth

Parce que les données vidéo sont complexes et sont constitués de nombreuses images, d&#39;information minière du matériel vidéo est difficile à faire sans l&#39;aide de logiciels informatiques. Vidéo bioinformatique est une approche puissante pour l&#39;extraction quantitative spatio-temporelle des données à partir d&#39;images vidéo en utilisant un logiciel informatique pour effectuer des mines datant et d&#39;analyse. Dans cet article, nous introduisons une méthode vidéo bioinformatique pour quantifier la croissance des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en analysant les vidéos time-lapse recueillies dans un incubateur à Nikon BioStation CT équipé d&#39;une caméra pour l&#39;imagerie vidéo. Dans nos expériences, les colonies de CSEh qui étaient attachés à Matrigel ont été filmés pendant 48 heures dans le CT BioStation. Pour déterminer le taux de croissance de ces colonies, les recettes ont été développées en utilisant CL-Quant logiciel qui permet aux utilisateurs d&#39;extraire divers types de données à partir d&#39;images vidéo. Pour évaluer avec précision la croissance de colonies, trois recettes ont été créées. La première segmentation de l&#39;image dans la colonie et le fond, le second rehaussé l&#39;image pour définir les colonies tout au long de la séquence vidéo avec précision, et le troisième a mesuré le nombre de pixels dans la colonie au cours du temps. Les trois recettes ont été exécutées en séquence sur les données recueillies dans la vidéo un CT BioStation d&#39;analyser le taux de croissance des colonies de CSEh individuelles de plus de 48 heures. Pour vérifier la véracité des recettes CL-Quant, les mêmes données ont été analysées manuellement en utilisant le logiciel Adobe Photoshop. Lorsque les données obtenues en utilisant les recettes CL-Quant et Photoshop ont été comparés, les résultats étaient pratiquement identiques, indiquant les recettes CL-Quant étaient véridiques. La méthode décrite ici pourrait être appliquée à toutes les données vidéo pour mesurer les taux de croissance de CSEh ou d&#39;autres cellules qui se développent dans les colonies. En outre, d&#39;autres vidéos de recettes bioinformatique peuvent être développés à l&#39;avenir pour d&#39;autres processus cellulaires tels que la migration, l&#39;apoptose et adhésion cellulaire.

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Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Vidéo bioinformatique est le traitement automatisé, l&#39;analyse, la compréhension et l&#39;exploration des données biologiques de la spatio-temporelle des données extraites de vidéos microscopiques. Le but de cet article est de démontrer une méthode pour mesurer la croissance embryonnaire humaine colonie de cellules souches en utilisant une méthode vidéo bioinformatique.

Vidéo analyse bioinformatique des droits de croissance de la tige colonie de cellules embryonnaires

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

video-bioinformatics-analysis-human-embryonic-stem-cell-colony

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K vues.  University of California. Vidéo bioinformatique est le traitement automatisé, l'analyse, la compréhension et l'exploration des données biologiques de la spatio-temporelle des données extraites de vidéos microscopiques. Le but de cet article est de démontrer une méthode pour mesurer la croissance embryonnaire humaine colonie de cellules souches en utilisant une méthode vidéo bioinformatique.

Vidéo: Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts of cell culture, and tend to acquire karyotypic abnormalities with high population doublings.  Proper passaging is essential for maintaining a healthy, undifferentiated, karyotypically normal HuES human embryonic stem cell culture.  First, an expanding culture is washed in PBS to remove residual media and cell debris, then cells are overlaid with a minimal volume of warm 0.05% Trypsin-EDTA.  Trypsin is left on the cells for up to five minutes, then cells are gently dislodged with a 2mL serological pipette.  The cell suspension is collected and mixed with a large volume of HuES media, then cells are collected by gentle centrifugation.  The inactivated trypsin media mixture is removed, and cells resuspended in pre-warmed HuES media.  An appropriate split ratio is calculated (generally 1:10 to 1:20), and cells re-plated onto a 1-2 day old plate containing a monolayer of irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells.  The newly seeded HuES culture plate is left undisturbed for 48 hrs, then media is changed every day thereafter.  It is important not to trpsinize down to a single cell suspension, as this increases the risk of introducing karyotypic abnormalities.

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin. Brought to you by JoVE.

HUES repiquage souches embryonnaires humaines lignées cellulaires à la trypsine

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

Recherche

Biologie

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Propagation des souches embryonnaires humaines (ES) Cellules

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Dérivation de cellules souches hématopoïétiques de cellules souches embryonnaires murines

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Dérivation des cellules souches embryonnaires humaines par Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Immunoprécipitation de la chromatine des cellules souches embryonnaires humaines

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

Culture et entretien des cellules souches embryonnaires humaines

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

L&#39;isolement et expansion à grande échelle des cellules adultes humaines Colony Forming progénitrices endothéliales

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

Isolement et animale expansion sans sérum du cordon ombilical humain dérivé cellules stromales mésenchymateuses (CSM) et des cellules endothéliales progénitrices Colony Forming (CPEF)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congélation et de décongélation cellules souches embryonnaires humaines

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

La différenciation des cellules souches embryonnaires en précurseurs d&#39;oligodendrocytes

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...