この作品は、グラントR15 CA137499 - 01（FB）とオハイオ大学（FB）からスタートアップ資金でNIHによって部分的にサポート。

1。マウスの大腿骨と脛骨と骨髄細胞の培養の解剖<ol><li> CO 2窒息により2匹を犠牲にし、慎重に骨の両端を切断することなく、脛骨と大腿骨を細かく分析。 </li><li>ティッシュペーパーを使用して接続されているすべての組織から骨をきれいに。骨を壊さないように注意してください。 </li><li> 35ミリメートルのシャーレに10分間70％エタノールに浸漬することによって骨を滅菌する。この瞬間から、細胞培養の汚染を避けるために、バイオセーフティフードの内部で動作する。 </li><li>エタノールからの骨を回復し、生物学的安全キャビネット内のシャーレの中で5分間、その空気が乾燥してみましょう。 </li><li>最薄先端が半分に大腿骨、及び脛骨をカット。 RPMI培地（無血清、抗生物質を含む）を1mlの滅菌シャーレに無菌注射器を使用して骨の内側を吹き込む。 </li><li>細胞懸濁液を回収し、スイング型バケットローター付き冷却遠心（4℃）の1,100 rpmで15 mlの遠心チューブ中で10分間の遠心によりRPMI培地で2倍洗浄する。 </li><li>最後の洗浄の後、ACK溶解緩衝液2mlに細胞を再懸濁し、赤血球を除去するために、室温で5分間インキュベートする。 </li><li> 10％FBSを含むRPMIの13 mlを追加し、再懸濁し、として1.6に説明したのと同じ設定を使用して、この培地で2X洗浄。 </li><li> 2に調整し、細胞をカウントするRPMI、10％FBS、およびrm - GM - CSF（20 ng / mlの最終濃度）5を追加すると× 10 5細胞/ ml。 </li><li> CO 2インキュベーター（37℃、5％CO 2）の滅菌、微生物学的品質、10cmペトリ皿、そして文化にこの懸濁液10mlを追加。 </li><li>三日後に、準備したプレートの各々にrmGM - CSFの20 ng / Lで含むRPMI、10％FBSの別の10 mlを加える。 </li><li>三日後に細胞懸濁液10mlを、各ペトリ皿から回収1.6のように遠心分離、rmGM - CSFとのRPMI、10％FBSの同じボリュームに再懸濁し、シャーレに返されます。細胞はCO 2インキュベーター内でさらに2日間培養されています。 </li></ol> 2。コレクションと樹状細胞のラベリング<ol><li>培養中の8日後にゆるく付着細胞を新鮮な培地とシャーレを洗浄することによって回収されます。このプロトコルは、私たちの手に、2〜4 × 10 8樹状細胞の周囲にレンダリングされます。細胞はフローサイトメトリーによってDCの表現型を分析することができます。 </li><li>回収した細胞を、製造元の指示に従って厳密にQtracker 655細胞標識キットで標識されています。 </li><li>我々は、10 nMの濃度でQdotsでマウス骨髄由来の樹状細胞を標識する優秀な結果を得た。これを達成するために、AとBキットのコンポーネントをラベル付けQtrackerの細胞のアリコートは、等量で混合、室温で5分間インキュベートし、直ちに30秒間ボルテックスで新鮮な培地で1 / 100に希釈されています</li><li> 5 × 10 6のDCを染色するために、エッペンドルフチューブと室温で5分間インキュベートするには各キットの構成要素とBの5μlを混合する。その後、1 RPMI、10％FBSインキュベートmlの、30秒間ボルテックスを追加。 </li><li> 5 × 10 6のDCを含む細胞懸濁液0.5 mlを加え、そして37℃で60分間。 </li><li>その後、RPMI、10％FBS（1,100 RPM）の2倍の細胞を洗う。細胞は、実験用マウスに注射するため、さらにカルチャまたはPBSでRPMIで再懸することができます。 </li></ol> 3。ラベルの付いたDCの評価<ol><li>細胞標識は、蛍光顕微鏡を用いて評価することができます。これを達成するために、細胞懸濁液の滴が（ 図3、顕微鏡のスライドに追加ガラスカバーで覆われ、そして蛍光顕微鏡は、それぞれこれらのQdotsが565nmと405 - 525nmの発光スペクトルおよび励起スペクトルを持っていることを考慮すると評価される） </li><li>この時点で、標識された細胞は、動物を注入することができます、または成熟は48時間、これらの細胞をインキュベートすることによって誘導することができる（37℃、5 CO 2）LPS（100 ng / ml）およびTNF -（の存在下で20 ng / ml）を。蛍光標識は、DCの成熟（ 図4）の影響を受けません。 </li></ol> 4。代表的な結果： 同封我々はマウス骨髄由来樹状細胞とその蛍光Qdotsとラベル付けを準備する方法について説明図。 1は、図一方、セルを取得する手順をまとめたものです。 2 Qdotsでそれらにラベルを付ける手順を示しています。 図に示す。 3、ほとんどすべての細胞は、この手順によってラベル付けされており、これは炎症性因子によるDCの成熟（ 図4）の影響を受けません。炎症カクテルで処理するとQdot ®二重染色のDC（Fig.5a）は 、非染色細胞に似て振舞うことを図5に示す。両方の細胞調製物は、同様に共刺激分子の発現（ 図5b）をアップレギュレート、および成熟の刺激によりIL - 6（ 図5C）と一酸化窒素（ 図5D）の同じような量を生成。これはpreviに同意Qdot ®二染色、免疫応答[6]を引き出すことができる成熟した細胞に有効にするDCの能力に影響しないことを示すOUが公開されたデータ。これらの細胞を実験動物に注入するために使用することができます。 図に示す。 6は 、2日間マウスに標識した樹状細胞の静脈内注射した後、我々は脾臓にQdot ®二染色細胞を検出することができた。これは、 生体内でも、DCの移行を評価するためにQdot ®二ナノ結晶の使用を示す以前公開されているデータと一致している[6]非侵襲的イメージングおよびフローサイトメトリーによる。 <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig1.jpg" alt="図1"/> 骨髄からDCの発生の 図1。 フローチャート 。同封我々は骨髄由来のDCを取得するためにその過程を描く。脛骨と大腿骨の両方に解剖し、周囲の組織からきれいにされています。骨のヒントは保持され、骨の内部は、培地にフラッシュされます。赤血球を除去した後、骨髄細胞は、樹状細胞にそれらを区別するためにGM - CSFの存在下で8日間培養する。 <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig2.jpg" alt="図2"/> ラベリング手順の 図2。 フローチャート 。 Qtrackerの細胞標識キットのコンポーネントの等しいアリコートAおよびBは、エッペンドルフチュー​​ブ内で混合される。樹状細胞はGM - CSFの8日間の骨髄培養物から採取し、37℃で60分間ラベリング色素と混合されています。その後、細胞は過剰の標識粒子を除去するために媒体中で洗浄されています。 <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。 直ちに標識後の樹状細胞の蛍光顕微鏡写真 。標識された細胞の滴をガラススライド上に堆積し、カバースリップでカバーされた。その後、サンプルはMicropublisher 5.0デジタルCCDカラーカメラ（Qimaging、サリー、BC、カナダ）を介して取得された蛍光顕微鏡と画像で評価した。 <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig4.jpg" alt="図4"/> 図4 in vitroで48時間の熟成後に樹状細胞の蛍光顕微鏡写真 。標識されたDCは、LPS（100 ng / ml）およびCO 2インキュベーター（37℃、5％CO 2）でスライドガラス上にTNF -α（20 ng / ml）の持つ48時間培養した。その後、サンプルは、PBS（5分、2X）で洗浄し、アセトン（15分、4℃）で固定し、DAPIで対比染色した。細胞は、上記のように蛍光顕微鏡で評価した。 <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig5.jpg" alt="図5"/> 図5。Qdot ®二ステンド成熟DCの生物活性 。上記のようにin vitroで成熟というラベルの樹状細胞は、フローサイトメトリー（）と（B）により分析した。 （）Qdot ®二染色細胞は、FL3（PercP）チャンネルで強いシグナルを与える。影付きのヒストグラム：未染色のコントロール。とアイソタイプコントロール、（B）Qdot ®二重染色し、染色の樹状細胞は、さらに成熟マーカーCD86とCD40に対する特異的抗体で染色した。次に、細胞をFACSortのフローサイトメーター（ベクトンディッキンソン、サンノゼ、カリフォルニア州）で分析した。さらに、IL - 6（C）と窒素酸化物は（NO）成熟したQdot ®二重染色DCおよびコントロールの上清で測定した。 IL - 6と一酸化窒素のレベルをELISA分析と我々は、以前は7に記載したようにグリースアッセイ、8により測定した。この図に示した全てのデータは、同様の結果を示す二、三の独立した実験の代表である。データは、GraphPadソフトウェアを使用してANOVAによって分析した。 <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig6.jpg" alt="図6"/> 図6。 切除組織における標識した樹状細胞の検出 。ラベル付け成熟DC（1 × 10 6細胞）を静脈内C57BL / 6マウスに注入した。 （）二日後マウスを屠殺し、脾臓を採取し、凍結OCTに埋め込まれており、クライオスタットを用いて調製8μMのセクションスナップ。その後、試料をアセトン（15分、4℃）で固定し、DAPIで対比染色した。細胞は、上記のように蛍光顕微鏡で評価した図6A：。40X倍率、 図6B：100X倍率、 図が。 6C、400Xの倍率。

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	<li>Banchereau, J., Briere, F., Caux, C., Davoust, J., Lebecque, S., Liu, Y. J., Pulendran, B., Palucka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).</li><li>Bonasio, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+migration+and+function+of+circulating+dendritic+cells.">Generation, migration and function of circulating dendritic cells.</a> Curr Opin Immunol. 18, 503-511 (2006).</li><li>Lanzavecchia, A., Sallusto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+instructive+role+of+dendritic+cells+on+T+cell+responses:+lineages,+plasticity+and+kinetics.">The instructive role of dendritic cells on T cell responses: lineages, plasticity and kinetics.</a> Curr Opin Immunol. 13, 291-298 (2001).</li><li>Conejo-Garcia, J. R., Benencia, F., Courreges, M. C., Kang, E., Mohamed-Hadley, A., Buckanovich, R. J., Holtz, D. O., Jenkins, A., Na, H., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-infiltrating+dendritic+cell+precursors+recruited+by+a+beta-defensin+contribute+to+vasculogenesis+under+the+influence+of+Vegf-A.">Tumor-infiltrating dendritic cell precursors recruited by a beta-defensin contribute to vasculogenesis under the influence of Vegf-A.</a> Nat Med. 10, 950-958 (2004).</li><li>Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> J Immunol Methods. 223, 77-92 (1999).</li><li>Noh, Y. W., Lim, Y. T., Chung, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+dendritic+cell+migration+into+lymph+nodes+using+near-infrared+fluorescent+semiconductor+nanocrystals.">Noninvasive imaging of dendritic cell migration into lymph nodes using near-infrared fluorescent semiconductor nanocrystals.</a> Faseb J. 22, 3908-3918 (2008).</li><li>Benencia, F., Courreges, M. C., Conejo-Garcia, J. R., Mohamed-Hadley, A., Zhang, L., Buckanovich, R. J., Carroll, R., Fraser, N., Coukos, G., Franco, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSV+oncolytic+therapy+upregulates+interferon-inducible+chemokines+and+recruits+immune+effector+cells+in+ovarian+cancer.">HSV oncolytic therapy upregulates interferon-inducible chemokines and recruits immune effector cells in ovarian cancer.</a> Mol Ther. 12, 789-802 (2005).</li><li>Gilboa, E., Vieweg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy+with+mRNA-transfected+dendritic+cells.">Cancer immunotherapy with mRNA-transfected dendritic cells.</a> Immunol Rev. 199, 251-263 (2004).</li><li>Grolleau-Julius, A., Abernathy, L., Harning, E., Yung, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+murine+dendritic+cell+antitumor+dysfunction+in+aging.">Mechanisms of murine dendritic cell antitumor dysfunction in aging.</a> Cancer Immunol Immunother. 58, 1935-1939 (2009).</li><li>Yrlid, U., Svensson, M., Johansson, C., Wick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+infection+of+bone+marrow-derived+macrophages+and+dendritic+cells:+influence+on+antigen+presentation+and+initiating+an+immune+response.">Salmonella infection of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells: influence on antigen presentation and initiating an immune response.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 27, 313-320 (2000).</li><li>Lutz, M. B., Schnare, M., Menges, M., Rossner, S., Rollinghoff, M., Schuler, G., Gessner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+functions+of+IL-4+receptor+types+I+and+II+for+dendritic+cell+maturation+and+IL-12+production+and+their+dependency+on+GM-CSF.">Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF.</a> J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).</li><li>Benencia, F., Courreges, M. C., Coukos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+tumor+antigen+vaccination+using+dendritic+cells:+comparison+of+RNA+electroporation+and+pulsing+with+UV-irradiated+tumor+cells.">Whole tumor antigen vaccination using dendritic cells: comparison of RNA electroporation and pulsing with UV-irradiated tumor cells.</a> J Transl Med. 6, 21-21 (2008).</li><li>Probst, H. C., Tschannen, K., Odermatt, B., Schwendener, R., Zinkernagel, R. M., Van Den Broek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+analysis+of+CD11c-DTR/GFP+mice+after+in+vivo+depletion+of+dendritic+cells.">Histological analysis of CD11c-DTR/GFP mice after in vivo depletion of dendritic cells.</a> Clin Exp Immunol. 141, 398-404 (2005).</li><li>Fainaru, O., Adini, A., Benny, O., Adini, I., Short, S., Bazinet, L., Nakai, K., Pravda, E., Hornstein, M. D., D'Amato, R. J., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+support+angiogenesis+and+promote+lesion+growth+in+a+murine+model+of+endometriosis.">Dendritic cells support angiogenesis and promote lesion growth in a murine model of endometriosis.</a> Faseb J. 22, 522-529 (2008).</li><li>Bobryshev, Y. V., Lord, R. S., Rainer, S., Jamal, O. S., Munro, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+dendritic+cells+and+atherosclerosis.">Vascular dendritic cells and atherosclerosis.</a> Pathol Res Pract. 192, 462-467 (1996).</li><li>Nakai, K., Fainaru, O., Bazinet, L., Pakneshan, P., Benny, O., Pravda, E., Folkman, J., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+augment+choroidal+neovascularization.">Dendritic cells augment choroidal neovascularization.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3666-3670 (2008).</li><li>Huarte, E., Cubillos-Ruiz, J. R., Nesbeth, Y. C., Scarlett, U. K., Martinez, D. G., Buckanovich, R. J., Benencia, F., Stan, R. V., Keler, T., Sarobe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+dendritic+cells+delays+ovarian+cancer+progression+by+boosting+antitumor+immunity.">Depletion of dendritic cells delays ovarian cancer progression by boosting antitumor immunity.</a> Cancer Res. 68, 7684-7691 (2008).</li><li>Fernandez Pujol, B., Lucibello, F. C., Zuzarte, M., Lutjens, P., Muller, R., Havemann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+derived+from+peripheral+monocytes+express+endothelial+markers+and+in+the+presence+of+angiogenic+growth+factors+differentiate+into+endothelial-like+cells.">Dendritic cells derived from peripheral monocytes express endothelial markers and in the presence of angiogenic growth factors differentiate into endothelial-like cells.</a> Eur J Cell Biol. 80, 99-110 (2001).</li><li>Gottfried, E., Kreutz, M., Haffner, S., Holler, E., Iacobelli, M., Andreesen, R., Eissner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+tumour-associated+dendritic+cells+into+endothelial-like+cells:+an+alternative+pathway+of+tumour+angiogenesis.">Differentiation of human tumour-associated dendritic cells into endothelial-like cells: an alternative pathway of tumour angiogenesis.</a> Scand J Immunol. 65, 329-335 (2007).</li><li>Bobryshev, Y. V., Lord, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+vascular+dendritic+cells+in+atherosclerotic+arteries+suggests+their+involvement+in+local+immune-inflammatory+reactions.">Mapping of vascular dendritic cells in atherosclerotic arteries suggests their involvement in local immune-inflammatory reactions.</a> Cardiovasc Res. 37, 799-810 (1998).</li><li>Bobryshev, Y. V., Lord, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-accumulation+of+dendritic+cells+and+natural+killer+T+cells+within+rupture-prone+regions+in+human+atherosclerotic+plaques.">Co-accumulation of dendritic cells and natural killer T cells within rupture-prone regions in human atherosclerotic plaques.</a> J Histochem Cytochem. 53, 781-785 (2005).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

T細胞相互作用またはDCの開発、および様々な疾患9-11にその役割を決定する：DCを調査、マウス骨髄性）DCが広く、DCベースのワクチンの有効性と改善を決定するために使用されている。同封我々は、脛骨と大腿骨の骨の髄から回収した前駆体からのDCを生成する方法を示します。そこで我々は、汚染の確率を減らすこと、私たちは70％エタノールに浸して、それらを殺菌することができるように、先端を切断することなく骨を回復する。骨髄細胞からDCを区別するために我々は、唯一、前述の5とGM - CSFを使用してください。一部のプロトコルはまた、IL - 4を使用していますが、それはGM - CSF 12の高レベルで作業する場合には、このサイトカインは必要ではないことが報告されている。実際、我々は以前にこれらのDCは免疫応答13を誘導することができることを実証した。また、介護が接続されている細胞はより多くの単球様表現型を示すので、培地とシャーレを洗浄することにより、8日間の培養物からだけ緩く接着細胞を回収するために取られる必要があります。ここでは、蛍光Qdot ®二粒子と樹状細胞のラベリングを示しています。この標識は、いくつかの利点が他のメソッドへの敬意を持っています。最初に、Qdots粒子は容易に細胞内に取り込まれている。第二に、蛍光シグナルは非常に高く、DCの成熟によって変更されません。第三に、蛍光は、細胞または組織をアセトンなどの溶剤で固定した場合のGFPが染色プロトコールを選択する時点でより多くの柔軟性を与え、DCが14をタグ付けするために使用されている場合にどうなるかに反して失われることはありません。最後に、これらの粒子によって与えられる高い蛍光シグナルは、組織自家蛍光にもかかわらず、細胞の可視化が可能になります。以前に6を説明されているように、Qdot ®二の染色は、これらの細胞の成熟の機能に影響を与えなかった。同封我々は、Qdot ®二重染色DCは共刺激分子をアップレギュレートし、炎症性刺激に応答してIL - 6と一酸化窒素の産生、非染色された樹状細胞と同様の方法で動作することを示している。 DCが免疫応答の引き金に特化した細胞であるが、これらは、癌やアテローム性動脈硬化症4、15、16などの病的状態に関与することが示されている。彼らはまた、さらに構造的に新しい血管19、20の開発に参加するよう提案、18、血管新生のプロセス17に参加することを主張されている。したがって、DCはin vivoで追跡し、異なる組織4で、その地理的な局在を決定するために可能にする方法、21、22は非常に貴重なものです。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> C57BL / 6マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td></td><td>女性、旧6-8週間</td></tr><tr><td> RPMI </td><td>インビトロジェン</td><td> 11875-119 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、修飾</td><td>インビトロジェン</td><td> 10437-028 </td><td></td></tr><tr><td>抗生物質、抗真菌</td><td>インビトロジェン</td><td> 15240-096 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 10010-049 </td><td></td></tr><tr><td> ACK溶解緩衝液</td><td>ロンザウォーカー株式会社</td><td> 10 - 548E </td><td></td></tr><tr><td>組換えマウスGM - CSF </td><td>ぺプロテック株式会社</td><td> 315から03 </td><td></td></tr><tr><td> Qtracker 655細胞標識キット</td><td>インビトロジェン</td><td> Q25021MP </td><td></td></tr><tr><td>リポ多糖類</td><td> Invivogen </td><td> tlrl - eblps </td><td></td></tr><tr><td>組換えマウスTNFアルファ</td><td>ペプロテック</td><td> 315 - 01A </td><td></td></tr><tr><td> CD86抗体</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 553691 </td><td></td></tr><tr><td> CD40抗体</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 553791 </td><td></td></tr><tr><td>グリース試薬システム</td><td>プロメガ</td><td> G2930 </td><td></td></tr><tr><td> IL - 6捕捉抗体</td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 13-7061-81 </td><td></td></tr><tr><td> IL - 6の検出抗体</td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 13-7062-81 </td><td></td></tr></tbody></table>

generation and labeling of murine bone marrow-derived dendritic cells with qdot nanocrystals for tracking studies

樹状細胞（DC）は末梢組織で、そのような胸腺、骨髄、脾臓、リンパ節やパイエル板1から3のような免疫臓器で発見プロフェッショナル抗原提示細胞（APC）です。樹状細胞は末梢組織のサンプルでは、​​占有プロセスと主要組織適合性分子（MHC）のコンテキストでそれらの表面に存在する抗原の存在、のための生物を紹介。その後、抗原負荷したDCは、彼らが特定の免疫応答をトリガTリンパ球に処理された抗原を提示する免疫器官に移行する。樹状細胞の遊走機能を評価する一つの方法は、蛍光色素4で、それらにラベルを付けることです。 同封我々はマウス骨髄由来DCにラベルを付けるためにQdot ®二蛍光ナノクリスタルの使用方法を示しています。この標識の利点は、Qdot ®二ナノ結晶が回復した組織で標識された細胞を検出するのに最適です安定して長期的な蛍光を有していることです。これを達成するために、最初の細胞はDCの分化を誘導するために、マウスの骨の髄から回収し、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の存在下で8日間培養されます。これらの細胞は、in vitroでのインキュベーションにおける短期で蛍光Qdotsで標識されます。染色した細胞を蛍光顕微鏡で視覚化することができます。細胞はこの時点では実験動物に注入することができますまたは炎症性刺激を用いたin vitroインキュベーションの際の成熟した細胞にすることができます。私たちの手では、DCの成熟は、蛍光シグナルの損失を決定していないもQdot ®二の染色は、樹状細胞の生物学的特性に影響を与えます。注入時には、これらの細胞は、典型的な解剖と固定の手順に従って蛍光顕微鏡による免疫器官で識別することができます。

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Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

樹状細胞の取り込み抗原およびT細胞に処理された抗原を提示する免疫器官に向かって移動する。 Qdot ®二ナノラベルは、長期的かつ安定的な蛍光シグナルを提供します。これは、蛍光顕微鏡により異なる臓器に樹状細胞を追跡できます。

追跡調査のためのQdot ®二ナノとマウス骨髄由来樹状細胞の世代とラベリング

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

generation-labeling-murine-bone-marrow-derived-dendritic-cells-with

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

24.8K ビュー.  Ohio University. 樹状細胞の取り込み抗原およびT細胞に処理された抗原を提示する免疫器官に向かって移動する。 Qdot ®二ナノラベルは、長期的かつ安定的な蛍光シグナルを提供します。これは、蛍光顕微鏡により異なる臓器に樹状細胞を追跡できます。

ビデオ: Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% CD11c high dendritic cells in culture that home to the draining lymph node after subcutaneous injection and present antigen to antigen specific T cells (see video). Additionally, we use Essen Instruments Incucyte to track dendritic cell maturation, where, at day 10, the morphology of the cultured cells is typical of a mature dendritic cell and &lt;85% of cells are CD11chigh. The study of antigen presentation in peripheral lymph nodes by 2-photon imaging revealed that there are three distinct phases of dendritic cell and T cell interaction1, 2. Phase I consists of brief serial contacts between highly motile antigen specific T cells and antigen carrying dendritic cells1, 2. Phase two is marked by prolonged contacts between antigen-specific T cell and antigen bearing dendritic cells1, 2. Finally, phase III is characterized by T cells detaching from dendritic cells, regaining motility and beginning to divide1, 2. This is one example of the type of antigen-specific interactions that can be analyzed by two-photon imaging of antigen-loaded cell tracker dye-labeled dendritic cells.

Antigen presentation in secondary lymphoid organs by dendritic cells is crucial for the initiation of the T cell mediated adaptive immune response. Here we demonstrate the culture of bone marrow derived murine dendritic cells, activation, and labeling for 2-photon imaging.

2光子イメージングで使用するための骨髄由来マウス樹状細胞の世代

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

生物学

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

使用して樹状細胞の移行の監視<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H磁気共鳴イメージング

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

免疫・感染学

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

機能研究のためのマウス骨髄好中球と養子移入実験の分離、精製とラベリング

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.

We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.

生産と一価量子ドットの標的

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

生物工学

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

マウス骨髄単球の追跡<em&gt;インビボ</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. The immune system is a constant balance in maintaining tolerance to self-molecules and reacting rapidly to pathogens. Dendritic cells (DCs) are powerful professional antigen presenting cells that link the innate immune system to the adaptive immune system and balance the adaptive response between self and non-self. Depending on the maturation signals, immature dendritic cells can be selectively stimulated to differentiate into immunogenic or tolerogenic DCs. Immunogenic dendritic cells provide proliferation signals to antigen-specific T cells for clonal expansion; while tolerogenic dendritic cells regulate tolerance by antigen-specific T-cell deletion or clonal expansion of regulatory T-cells. Due to this unique property, dendritic cells are highly sought after as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases. Dendritic cells can be loaded with specific antigens in vitro and injected into the human body to mount a specific immune response both immunogenic and tolerogenic. This work presents a means to generate in vitro from monocytes, immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), tolerogenic and mature moDCs that differ in surface marker expression, function and metabolic phenotypes.

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

代謝表現型が異なる未熟、熟女と寛容原性樹状細胞の生成

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

マウスの骨髄からGM-CSF由来肺胞のようなマクロファージや樹状細胞の生成および同定

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

大量の骨髄前駆細胞と新規セルソーティング戦略を使用してマウスの骨髄から樹状細胞前駆体の生成

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

マウスから骨髄由来樹状細胞を単離および培養するための経済的かつ効率的なプロトコル

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

マウス骨髄由来の樹状細胞とマクロファージの蛍光融合タンパク質の発現

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

追跡調査のためのQdot ®二ナノとマウス骨髄由来樹状細胞の世代とラベリング

要約

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