이 작품은 그랜트 R15 CA137499 - 01 (FB)와 오하이오 대학교 (FB)에서 시작 기금에서 NIH에 의해 부분적으로 지원.

1. 마우스 대퇴골 및 골수 세포의 tibiae과 문화의 해부 <ol><li> CO 2 질식을 2 마우스를 희생하고 조심스럽게 뼈 끝을 절단하지 않고 tibias과 대퇴골을 해부하다. </li><li> 조직 용지를 사용하여 모든 첨부된 조직에서 뼈를 청소합니다. 뼈를 부러하지 않도록주의하십시오. </li><li> 35mm 페트리 접시에서 10 분 70 % 에탄올에 집중하여 뼈를 소독. 지금이 순간부터, 세포 문화의 오염을 피하기 위해 biosafety 후드 내부 작동합니다. </li><li> 에탄올에서 뼈를 복구하고 biosafety 캐비닛 내부는 배양 접시에 5 분 위해 공기가 건조 보자. </li><li> 그 껍질이 얇고 팁에 의해 절반으로 대퇴골과 경골을 잘라요. 멸균 페트리 접시에 멸균 주사기를 사용하여 RPMI 매체 1 ML (혈청없이하지만 항생제 포함)과 뼈 안쪽을 달이다. </li><li> 세포 현탁액은 스윙 버킷 회전자와 냉장 원심 분리기에서 1,100 RPM (4 ° C)에서 15 ML의 원심 분리기 튜브에서 10 분 원심 분리하여 RPMI 매체에서 수집하고 배 세탁합니다. </li><li> 마지막 세척 후, ACK 용해 버퍼 2 ML에있는 세포를 resuspend와 적혈구를 제거하기 위해 상온에서 5 분 알을 품다. </li><li> 10% FBS와 RPMI 13 ML 추가 resuspend과 같은 1.6에서 설명한 동일한 설정이 매체 배 세척. </li><li> 2 조정, 세포를 카운트 RPMI 10% FBS 및 RM - GM - CSF (20 NG / ML 최종 농도) 5를 추가로 X 10 5 세포 / ML. </li><li> CO 2 배양기 (37 ° C, 5 % CO 2)의 살균, 미생물 품질, 10cm 페트리 접시, 문화이 정지 10 ML을 추가합니다. </li><li> 사흘 후, 준비된 접시 각 rmGM - CSF 20 NG / L로 RPMI 10% FBS의 또 다른 10 ML를 추가합니다. </li><li> 세포 현탁액 3 일 이후 10 ML은 각 페트리 접시에서 발견한 1​​.6에서와 같이 centrifuged, rmGM - CSF와 RPMI 10% FBS 같은 볼륨에서 resuspended하고 페트리 접시에 반환됩니다. 세포가 CO 2 배양기에서 2 일간 추가 양식입니다. </li></ol> 2. 수집 및 DC가의 라벨 <ol><li> 문화 8 일 후에 느슨하게 자기편 세포는 새로운 매체와 배양 접시를 세척하여 복구할 수 있습니다. 이 프로토콜은 우리 손에 2-4 X10 8 DC가 주위를 렌더링. 세포 유동세포계측법로 직류에 대한 표현형 분석하실 수 있습니다. </li><li> 수집된 세포는 다음 엄격히 제조 업체의 지침에 따라 Qtracker 655 셀 라벨링 키트와 함께 표시됩니다. </li><li> 우리는 우수한 결과를 10 nm의 농도에서 Qdots 함께 murine 골수 파생 DC가를 라벨어요. 이것을 달성하기 위해, Qtracker 셀 라벨링 키트 구성 요소 aliquots는 A와 B는 동일한 볼륨에 혼합 상온에서 5 분 incubated하고, 즉시 30 S.에 대한 vortexing 신선한 중간의 1 / 100 희석 아르 </li><li> 5 X 10 6 DC가를 얼룩이, 각각의 키트 구성 요소 eppendorf 튜브와 온도는 실온에서 5 분 품어에서 A와 B의 5 μl를 섞는다. 그런 다음, 1 RPMI 10% FBS 부화의 ML, 30 초 와동를 추가합니다. </li><li> 5 X10 6 DC가를 포함하는 세포 현탁액의 0.5 ML를 추가하고, 37 품어 ° C를 60 분. </li><li> 그런 다음, RPMI 10% FBS (1100 RPM)에 배 세포를 씻으십시오. 세포 실험 생쥐에 주입에 대한 자세한 문화 또는 PBS의 RPMI에 resuspended 수 있습니다. </li></ol> 3. 분류 DC 평가 <ol><li> 셀 라벨은 형광 현미경에 의해 평가할 수있다. 이것을 달성하기 위해, 세포 현탁액의 드롭은 (그림 3, 현미경 슬라이드에 추가 유리 coverslip으로 덮여 및 형광 현미경은 각각이 Qdots는 565nm와 405 - 525nm의 방출 및 여기 스펙트럼을 가지고 고려와 평가 ) </li><li> 이 시점에서, 라벨 세포는 동물을 주입하는 데 사용할 수있는, 또는 성숙은 48 H 이러한 세포를 잠복기에 의해 유도된 수 있습니다 (37 ° C, 5 CO 2) LPS (100 NG / ML)와 TNF - (존재 20 NG / ML). 형광 라벨은 DC의 성숙 (그림 4)에 의해 영향을받지 않습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 즉결 우리는 murine 골수 파생 DC가를 준비하는 방법을 설명 방법과 형광 Qdots으로 그들을 분류. 그림. 그림 동안 1, 세포를 얻을 수있는 절차를 요약한 것입니다. 2 Qdots 그들을 분류하는 절차를 묘사. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 3, 거의 모든 세포가이 절차에 의해 표시되며, 이것은 염증 요인과 DC의 성숙 (그림 4). 그림에 영향을받지 않습니다. 염증성 칵테일로 치료하면 Qdot 묻은 DC가 (Fig.5a)가 아닌 묻은 세포와 유사한 동작되는 5 보여줍니다. 두 세포 준비는 비슷하게 costimulatory 분자의 표현 (그림의 5B)를 upregulate 및 성숙의 자극시 IL - 6 (그림 5C)와 질산 산화물 (그림 5D)의 유사한 양을 생산하고 있습니다. 이것은 previ 동의그 Qdot의 얼룩을 나타내는 ous 게시된 데이터는 면역 응답을 할 [6]을 도출 능력 성숙 세포로 전환될 DC의 능력에 영향을주지 않습니다. 이러한 세포는 다음 실험 동물을 주입 사용할 수 있습니다. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 6 2 일 생쥐로 분류 DC가의 정맥 주사 후, 우리는 비장의 Qdot 묻은 세포를 감지할 수 있었다. 이것은 또한 생체내에서 DC의 마이 그 레이션을 평가 Qdot nanocrystals의 사용을 보여주는 이전 게시된 데이터와 계약에 [6] 비침습 이미징 및 유동세포계측법에 의해. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig1.jpg" alt="그림 1"/> 골수에서 DC 생성 그림 1. 플로우 차트. 즉결 우리는 골수 파생 DC를 얻는 과정을 묘사. 모두 tibias 및 대퇴골은 해부와 조직을 주변에서 청소됩니다. 본 도움말은 보존되고 뼈 내부는 매체로 플러시됩니다. 적혈구를 제거 후, ​​골수 세포는 DC가로 그들을 차별화하는 GM - CSF의 존재에 8 일간 ​​양식입니다. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig2.jpg" alt="그림 2"/> 상표 절차 그림 2. 플로우 차트. Qtracker 셀 라벨링 키트 구성 요소의 동일 aliquots는 A와 B는 eppendorf 튜브에 혼합됩니다. 돌기 세포는 GM - CSF와 함께 8 일 골수 문화에서 수집하고 37C에서 60 분에 대한 상표 염료와 혼합됩니다. 그러면 세포는 과도한 라벨 입자를 제거 미디어 씻어 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 즉시 라벨링 후 DC가의 형광등 microphotography. 분류 세포의 방울은 유리 슬라이드에 예치하고 coverslip이 적용되었습니다. 그런 다음 샘플은 형광 현미경으로 평가되었고 이미지는 Micropublisher 5.0 디지털 CCD 컬러 카메라 (Qimaging, 써리, BC 캐나다)를 통해 획득한되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 체외에서 48 H의 성숙 이후에 DC가의 형광등 microphotography. 분류 DC가이 LPS (100 NG / ML)과 CO 2 배양기 (37 ° C, 5 % CO 2)에 유리 슬라이드에 TNF - α (20 NG / ML) 48 H에 대한 교양되었습니다. 그런 다음 샘플은 PBS (5 분, 2X)로 씻은 아세톤 (15 분, 4 ° C)에 고정하고 DAPI와 counterstained되었습니다. 세포는 위와 같이 형광 현미경으로 평가했다. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig5.jpg" alt="그림 5"/> 그림 5. Qdot 스테인드 성숙 DC가의 생물 학적 활동. 위와 같이 체외에서 성숙 표시 DC가이 유동세포계측법 (A)에 의해 분석 (B) 하였다. (A) Qdot 묻은 세포는 FL3 (PercP) 채널에 강력한 신호를 제공합니다. 음영 히스토그램 : 흠없는 제어할 수 있습니다. 그리고 isotype 컨트롤, (B) Qdot 묻은과 흠없는 DC가가 추가로 성숙 마커 CD86과 CD40에 대한 구체적인 항체 물들일되었습니다. 세포는 다음 FACSort 흐름 cytometer (백톤 디킨슨, 산호세, CA)에서 분석했다. 또한 IL - 6 (C)과 질소의 산화물은 (NO) 성숙 Qdot 묻은 DCS 및 컨트롤 supernatants에서 결정됩니다. IL - 6와 질산 산화물의 수준은 엘리사 분석 및 우리가 이전에 7 설명한 것처럼 Griess 분석 8에 의해 결정됩니다. 이 그림에서 보여준 모든 데이터는 유사한 결과를 보여주는 두 개 또는 세 독립적인 실험의 대표입니다. 데이터 GraphPad 소프트웨어를 사용하여 ANOVA로 분석되었다. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig6.jpg" alt="그림 6"/> 그림 6. 해부 조직에 표시 DC가 탐지. 분류 성숙한 DC가 (1x10 6 셀)를 정맥 C57BL / 6 마우스에 주입했다. (A) 2 일 후 생쥐가 희생되었고 수집 spleens, 냉동 스냅, 10 월에 박혀 8 μm의 섹션 그라 이오 스탯을 사용하여 준비 하였다. 그런 다음 샘플은 아세톤 (15 분, 4 ° C)에 고정하고 DAPI와 counterstained되었습니다. 세포는 위와 같이 형광 현미경으로 평가되었다 그림 6A :. 40X 배율, 그림 6B : 100X 확대, 그림이. 6C, 400X 확대.

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	<li>Banchereau, J., Briere, F., Caux, C., Davoust, J., Lebecque, S., Liu, Y. J., Pulendran, B., Palucka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).</li><li>Bonasio, R., von Andrian, U. 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V., Lord, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+vascular+dendritic+cells+in+atherosclerotic+arteries+suggests+their+involvement+in+local+immune-inflammatory+reactions.">Mapping of vascular dendritic cells in atherosclerotic arteries suggests their involvement in local immune-inflammatory reactions.</a> Cardiovasc Res. 37, 799-810 (1998).</li><li>Bobryshev, Y. V., Lord, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-accumulation+of+dendritic+cells+and+natural+killer+T+cells+within+rupture-prone+regions+in+human+atherosclerotic+plaques.">Co-accumulation of dendritic cells and natural killer T cells within rupture-prone regions in human atherosclerotic plaques.</a> J Histochem Cytochem. 53, 781-785 (2005).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

T 세포 상호 작용 또는 DC 개발 및 다양한 질병 9-11에서 역할을 결정 : DC를 조사, Murine 골수양) DC가이 광범위 DC 기반의 백신의 효능 및 개선을 결정하기 위해 사용되었습니다. 즉결 우리는 tibias 및 대퇴골 뼈 marrows에서 발견한 엽 성의 전구 물질에서 DC가를 생성하는 방법을 보여줍니다. 우리는 따라서 오염의 가능성을 줄이고, 우리가 에탄올 70%에 잠수하여 그들을 소독 수 있도록 도움말을 절단하지 않고 뼈를 복구합니다. 골수 세포에서 DC가을 차별화하는 데 우리는 이전에 설명한 5 GM - CSF를 사용합니다. 일부 프로토콜은 또한 IL - 4를 사용하지만, 그것은 GM - CSF 12 높은 수준의 작업을 때이 시토킨가 필요 없다는보고되었습니다. 사실, 우리는 이전에 다음과 DC가이 면역 반응 13 유도 할 수 있다고 증명하고있다. 또한, 관심이 첨부된 세포가보다 단핵구와 같은 표현형을 보여 이후 매체와 배양 접시를 세척하여 8 일간의 문화에서 불과 느슨하게 자기편 세포를 복구하는 데주의가 필요하다. 여기 형광 Qdot 입자와 DC가의 라벨을 보여줍니다. 이 레이블은 다른 방법을 몇 가지 장점을 존중하고 있습니다. 첫째, Qdots 입자는 쉽게 세포에 포함됩니다. 둘째, 형광 신호가 매우 높은 및 DC 성숙에 의해 변경되지 않습니다. 세포 또는 조직이 GFP가 얼룩 프로토콜을 선택하는 순간에 더 많은 유연성을 제공, DC가 14 태그를 사용하면 어떻게 반대로 같은 아세톤과 같은 용매와 고정하는 경우 셋째, 형광가 손실되지 않습니다. 마지막으로,이 입자에 의해 주어진 높은 형광 신호는 조직 자동 형광에도 불구하고 세포의 시각화 수 있습니다. 이전 6 설명한 바와 같이, Qdot의 얼룩이 세포의 성숙 기능에 영향을주지 않았다. 즉결 우리는 Qdot 묻은 DC가이 costimulatory 분자를 upregulating하고, 염증성 자극에 대한 응답으로 IL - 6와 질산 산화물을 생산, 비 - 스테인드 DC가 같은 유사한 방식으로 동작한다는 것을 보여주기. DC가이 면역 반응을 트리거링 전문 세포가 있지만, 그들은 이러한 암, 죽상 경화증 4, 15, 16과 같은 병적인 조건에 참여하는 표시되었습니다. 그들은 또한 구조적도 새로운 혈관 19, 20 개발에 참여하는 등 제안 angiogenic 과정 17, 18,에 참여하는 주장했습니다. 따라서, DC는 생체내에서 추적하고, 다른 조직 4 21 그들의 지리적 지역화를 결정하는 허용 방법은, 22 매우 가치가 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> C57BL / 6 마​​우스 </td><td> 잭슨 실험실 </td><td></td><td> 여자들, 오래된 6~8주 </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-119 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 자격을 갖춘 </td><td> Invitrogen </td><td> 10437-028 </td><td></td></tr><tr><td> 항생제 - antimycotic </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-096 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10010-049 </td><td></td></tr><tr><td> ACK Lysing 버퍼 </td><td> Lonza 워커스빌, Inc의 </td><td> 10 - 548E </td><td></td></tr><tr><td> GM - CSF 재조합 murine </td><td> PeproTech 부동산 </td><td> 315-03 </td><td></td></tr><tr><td> Qtracker 655 셀 라벨 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> Q25021MP </td><td></td></tr><tr><td> Lipopolysaccharide </td><td> Invivogen </td><td> tlrl - eblps </td><td></td></tr><tr><td> 재조합 murine TNF 알파 </td><td> Peprotech </td><td> 315 - 01A </td><td></td></tr><tr><td> CD86 항체 </td><td> BD Biosciences </td><td> 553691 </td><td></td></tr><tr><td> CD40 항체 </td><td> BD Biosciences </td><td> 553791 </td><td></td></tr><tr><td> Griess 시약 시스템 </td><td> Promega </td><td> G2930 </td><td></td></tr><tr><td> IL - 6 캡쳐 항체 </td><td> eBioscience </td><td> 13-7061-81 </td><td></td></tr><tr><td> IL - 6 항체 검출 </td><td> eBioscience </td><td> 13-7062-81 </td><td></td></tr></tbody></table>

generation and labeling of murine bone marrow-derived dendritic cells with qdot nanocrystals for tracking studies

돌기 세포 (DCS)는 주변 조직과 같은 thymus, 골수, 비장, 림프절과 Peyer의 패치를 1-3으로 면역 장기에서 발견 항원 제시 세포 전문 (APCs)입니다. DC가가 주변 조직 샘플에 그들이 걸릴 프로세스 및 주요 histocompatibility 분자 (MHC)의 맥락에서 그들의 표면에있는 항원의 존재에 대한 유기체를 제시한다. 그런 다음, 항원 - 로드된 DC가들은 특정 면역 반응을 실행 T lymphocytes로 처리 항원을 제시 면역 장기로 마이 그 레이션. DC가의 철새 기능을 평가하는 한 가지 방법은 형광 염료 4 그들을 분류하는 것입니다. 즉결 우리는 murine 골수 파생 DC 레이블을 Qdot 형광 nanocrystals의 사용을 보여줍니다. 이 분류의 장점은 Qdot nanocrystals가 회복 조직에 표시된 세포를 검출에 이상적하게 안정적이고 오래 지속 형광을 가지고있다. 이것을 달성하기 위해, 최초의 세포는 DC의 차별을 유도하기 위해 murine 뼈 marrows에서 발견한 및 과립구 대식 세포 콜로니 자극 인자 -의 존재에 8 일 동안 교양 것입니다. 이러한 전지는 다음 체외 보육의 짧은하여 형광 Qdots이 표시됩니다. 스테인드 세포는 형광 현미경과 시각 수 있습니다. 세포는이 시점에서 실험 동물에 주입 수있다 또는 염증성 자극과 함께 체외 보육시 성숙한 세포로 수 있습니다. 우리 손에, DC의 성숙은 형광 신호의 손실을 결정 안이나 Qdot의 얼룩은 DC가의 생물 학적 특성에는 영향을 미치지 않습니다. 주입시 이들 세포는 전형적인 해부와 고정 절차를 다음과 형광 현미경에 의해 면역 장기에서 확인할 수 있습니다.

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Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

돌기 세포의 이해의 항원과 T 세포 항원 처리를 제시 면역 기관으로 마이 그 레이션. Qdot nanocrystal 라벨은 오랫동안 안정 형광 신호를 제공합니다. 이것은 형광 현미경에 의해 다른 기관에 돌기 세포 추적하실 수 있습니다.

추적 연구 Qdot Nanocrystals와 Murine 골수 파생 돌기 세포의 생성 및 라벨링

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

24.7K 조회수.  Ohio University. 돌기 세포의 이해의 항원과 T 세포 항원 처리를 제시 면역 기관으로 마이 그 레이션. Qdot nanocrystal 라벨은 오랫동안 안정 형광 신호를 제공합니다. 이것은 형광 현미경에 의해 다른 기관에 돌기 세포 추적하실 수 있습니다.

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Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

골수 유래 대 식세포를 사용하여 대식 세포 분극 조사

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

연구

면역학 및 감염병학

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

뼈 대식 세포 생산에게 골수 유래

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

분리 및 설치류 골수의 정맥 주사 유래 단핵구

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. The immune system is a constant balance in maintaining tolerance to self-molecules and reacting rapidly to pathogens. Dendritic cells (DCs) are powerful professional antigen presenting cells that link the innate immune system to the adaptive immune system and balance the adaptive response between self and non-self. Depending on the maturation signals, immature dendritic cells can be selectively stimulated to differentiate into immunogenic or tolerogenic DCs. Immunogenic dendritic cells provide proliferation signals to antigen-specific T cells for clonal expansion; while tolerogenic dendritic cells regulate tolerance by antigen-specific T-cell deletion or clonal expansion of regulatory T-cells. Due to this unique property, dendritic cells are highly sought after as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases. Dendritic cells can be loaded with specific antigens in vitro and injected into the human body to mount a specific immune response both immunogenic and tolerogenic. This work presents a means to generate in vitro from monocytes, immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), tolerogenic and mature moDCs that differ in surface marker expression, function and metabolic phenotypes.

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

대사 표현형을 각기 다른 미성숙, 성숙 및 Tolerogenic 수지상 세포의 생성

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

마우스 골수에서 생성 및 GM-CSF의 식별 파생 폐포와 같은 대 식세포와 수지상 세포

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

골수성 창시자 및 정렬 전략 소설 셀을 사용 하 여 Murine 골에서 수지상 세포 선구자의 큰 숫자의 생성

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

An &lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Mouse Model to Measure Na&amp;#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Vivo에서 마우스 모델을 측정 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산 및 골 수 유래 수지상 세포에 의해 유도 된 Th1 차별화

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

마우스로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 배양하기 위한 경제적이고 효율적인 프로토콜

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...