Nous tenons à remercier Ann Mei Lim pour la lecture critique du manuscrit et d&#39;autres membres de notre laboratoire pour leurs discussions tout au long de ce travail. Ce travail a été financé par Yamada Science Foundation et de la Royal Society bourses courte visite et de l&#39;UE internationale Marie Curie Fellowship GRR entrant à KK, et le BBSRC de subvention de projet (BB/H002278/1) et le Wellcome Trust Equipment Grant (073228/Z/03/Z) à AH

1. Collection de larves par étapes <ol><li> Place 15 filles et 15 mouches adultes de sexe masculin dans une cage cylindrique en plexiglas pour pondre leurs œufs sur une boîte de Pétri avec de l&#39;agar et le jus de raisin complété par une petite boule de pâte de levure pendant 3 heures à 25 ° C. Changer la plaque 3-4 fois par jour, et jetez la première plaque (c.-à partir de l&#39;O / N oeuf-lay). Jetez également les plaques de la première journée. Dès le deuxième jour, gardez les plaques avec des œufs à 25 ° C. Après 7 jours de collecte des œufs, commencez avec une nouvelle mise en place des mouches parents. </li><li> Après environ 24 heures, les larves éclosent des œufs. En accrochant les larves avec un pinceau ou dilué avec une paire de pinces, transférer 35 larves de l&#39;agar de raisin dans un flacon contenant de la nourriture volée standard (10 ml) (figure 1A). </li><li> Maintenir les flacons contenant des larves pendant 3 jours (96 heures après la ponte, AEL) à 25 ° C. </li></ol> 2. Dissection des larves Cordons nerveuse ventrale de la Culture <ol><li> Nettoyez êtrench et les mains avec de l&#39;éthanol à 70%. Faire tremper 4 blocs de coloration, 2 paires de pinces et d&#39;une aiguille avec de l&#39;éthanol à 70%, et laisser sécher à l&#39;air. </li><li> Préparer 4 blocs de coloration avec les médias suivants: une avec de l&#39;eau distillée (DW) à nettoyer et à larves piscine nettoyée, une deuxième avec 2 ml de bouclier et Sang M3 moyen insecte avec 1% de pénicilline et de la streptomycine, Ecdysone frais (M3 PS moyenne) de disséquer les larves, et un troisième avec 2 ml de M3 PS moyen de mettre en commun disséqués cordons nerveux ventral (VNC), et un quatrième avec 2 ml de M3 PS moyen de poignarder les VNC. Tous les réactifs doivent être préchauffée à la température ambiante. </li><li> Ajouter de l&#39;eau dans le flacon contenant 96 h AEL larves. Puis, à l&#39;aide d&#39;une spatule, écartez doucement la nourriture par les larves de la fiole sur une serviette en papier humide. Transférer 10 larves à un bloc de coloration contenant DW pour laver les aliments. Remplacer DW 6 fois. Puis remplacez-le par M3 PS support. </li><li> Transfert un des larves à un bloc de coloration contenant 2 ml de milieu M3 PS. </li><li> Sous une loupe binoculaire, dissect un cerveau larvaire avec soin en utilisant des méthodes standard 12, mais pour minimiser les dommages aux tissus, prendre des précautions particulières en procédant de la manière suivante. Placez la face dorsale larve haut, et la face dorsale moins un tiers de l&#39;extrémité antérieure avec 2 paires de pinces (une dans chaque main). Tout en maintenant la partie antérieure, se détacher de l&#39;extrémité postérieure de la pince, et à la déchirure de l&#39;épiderme. Le cerveau et la VNC doit être visible depuis le bord postérieur de la moitié antérieure. Soin d&#39;isoler le cerveau et complexe VNC en enlevant la graisse corporelle, de l&#39;intestin et de l&#39;épiderme. Lorsque les VNC sont trop endommagés, les VNC va dégénérer totalement ou partiellement, même sans avoir poignardé blessures. Prenez en compte les points suivants: </li></ol><ul><li> Ne pas tirer ou arracher les disques imaginaux et des nerfs périphériques du thorax VNC car cela pourrait endommager la VNC. Pour couper les nerfs périphériques, maintenez les nerfs périphériques avec deux paires de pinces placées à proximité les uns les autres, puis tirez sur les nerfs avec l&#39;d&#39;cèpes. Disques imaginaux et des pièces buccales peuvent être laissés attachés à la VNC. </li><li> Laisser la glande anneau et des ganglions lymphatiques attaché au cerveau. </li><li> Couper le tube digestif au point le plus proche du cerveau, où la nourriture est pas très contenue. </li></ul><ol start="6"><li> En utilisant un pipetman P20 avec le bout coupé et élargi un peu, transférer le VNC pour une salière contenant nouvelle M3 PS support. Avant de transférer le VNC, première pipette de haut en bas que le support utilisé pour la dissection afin d&#39;éviter la VNC de coller à la pointe. </li></ol> 3. Stabbing blessures à la VNC Drosophile larvaire Cette section explique comment effectuer une blessure lancinante à la VNC, et de préparer poignardé-VNC pour time-lapse analyse et immunomarquage. Conditions de culture post-coup de poignard et la durée sont décrits à la section 5 (pour time-lapse analyse) et à l&#39;article 6 (pour immunomarquage). <ol><li> Après la mise en commun suffisamment de VNC (4-5 pour time-lapseet plus de 24 pour immunomarquage), transférer une VNC pour une salière propre contenant M3 PS. </li><li> Orientez le VNC pour que le neuropile dorsale est en vue sous le microscope à dissection (figure 1B). Telle est l&#39;orientation la plus naturelle pour VNC pour s&#39;allonger dans lorsqu&#39;ils sont attachés à les lobes optiques. </li><li> Stab manuellement à l&#39;aide d&#39;une aiguille de tungstène sous le microscope de dissection, de la face dorsale pratiquement à angle droit et de parvenir à la moitié de l&#39;abdomen du VNC (figure 1B). </li></ol> Prenez une attention particulière à ce qui suit: <ul><li> Stab qu&#39;une seule fois. </li><li> Stab ce que l&#39;aiguille touche le fond du verre. Attention cependant à ne pas endommager la pointe de l&#39;aiguille. </li><li> La tige du porte-aiguille ne doit pas toucher le milieu lors de coups de couteau. </li><li> La blessure n&#39;est pas visible sous le microscope de dissection. </li></ul> Remarque: Stab-accident sans rapport avec la dégénérescence La procédurepeut entraîner une dégénérescence cellulaire dans le VNC distincte de la lésion coups de couteau. Résultats dégénérescence des trous dans l&#39;neuropile, et parfois des trous ont été observées dans le cortex des spécimens non poignardé. Les échantillons présentant une dégénérescence affectant la dégénérescence neuropile ou généralisée affecte également la surface VNC doit être jeté. Dégénérescence peuvent être identifiés comme suit: <ul><li> Surface rugueuse, en particulier dans la zone latérale / ventrale du thorax, à 22 h coup de couteau. Dans les cas extrêmes, la VNC semble saillie. </li><li> Des trous ou des vacuoles dans la neuropile thoracique, qui peuvent être visibles en tant que signal de trous dans le fond avec immunomarquage fluorescence. </li></ul> 4. Entretien de l&#39;aiguille et pince <ul><li> Vérifiez régulièrement si la pointe de l&#39;aiguille est assez tranchant. La pointe de l&#39;aiguille peut être tordue ou émoussée après l&#39;avoir utilisé pour des expériences de plusieurs années. Dans ce cas, aiguiser la pointe à l&#39;aide d&#39;une pierre d&#39;Arkansas ou équivalent. </li><li> Les pointes de la pince doitrépondre parfaitement. Les conseils peuvent être endommagées avec l&#39;usage. Dans ce cas, ajustez la pointe à l&#39;aide d&#39;une pierre Arkansas ou équivalent. </li></ul> 5. Enregistrement Culture et Time-lapse de VNC Poignardé Pour visualiser le neuropile axonale dans la vie VNC, une ligne GFP piège protéine qui qualifie tous les axones - G9 13 - peuvent être utilisés, et de visualiser toutes les cellules gliales (à l&#39;exception de la glie ligne médiane), le pilote gliales repoGAL4 peut être utilisée pour exprimer la UASdsRed S197Y 14 journaliste. Par croisement G9 vole à UASdsRedS197Y;; repoGAL4 mouches, VNC de larves descendants sont obtenus avec des axones verts et des cellules gliales rouge qui peuvent être enregistrées dans les tissus vivants. <ol><li> Après la mise en commun VNC 5.4, transfert 1 VNC pour une salière propre contenant 2 ml de M3 PS, et le poignarder la moitié abdominale of the VNC, comme indiqué à la section 3. </li><li> Transférer la poignardé VNC à une poly-L-lysine recouvert de verre 3,5 mm en bas boîtes de Pétri contenant 1 ml de M3PS. Placez le côté VNC dorsale vers le bas. Poussez doucement la VNC en utilisant le côté plat d&#39;une paire de pince pour permettre à la VNC de coller au plat. </li><li> Ajouter délicatement 1 ml de FBS M3 PS 15% rendant la concentration finale de FBS à 7,5%. </li><li> Acquérir des images à l&#39;aide microscopie confocale à balayage laser. Numériser le VNC, la collecte d&#39;une série Z de section sur toute son épaisseur. Nous avons utilisé un Leica SP2 microscope inversé confocal avec une température de chambre de l&#39;environnement contrôlé. Un microscope confocal équivalent devrait fonctionner, mais il peut exiger l&#39;optimisation des paramètres de numérisation. Les paramètres de notre time-lapse de microscopie confocale ont été les suivantes: Température de la chambre de l&#39;environnement: 25 ° C; 20X objectif avec zoom 4 fois; mode de balayage xyzt, avec une résolution de 512x512 pixels, z = 1 um et étapes de 1 heure ou 2 - intervalles d&#39;une heure. </li></ol><ul><li> Le microscope confocal Leica SP2 a une limitation de taille de fichier pour la numérisation. Avec ces paramètres, 8-9 points dans le temps peuvent être numérisés. Avecautres microscopie confocale, il devrait être possible d&#39;acquérir des piles d&#39;images pour les points de temps plus longues, c&#39;est à dire sur la durée maximale de 24 heures. </li></ul> 6. Culture et immunocoloration de VNC poignardé et fixe <ol><li> Préparer une plaque de 24 puits de culture de tissu contenant 500 ul de FBS M3 PS 7,5% par puits. </li><li> Répétez la dissection de plus de 24 VNC pour un plat de 24 puits de culture de tissu. </li><li> En utilisant le pipetman P20 avec la pointe coupée, transfert 12 VNC non poignardé de la piscine à la boîte de culture, en utilisant 1 VNC par puits. </li><li> Stab le reste de VNC dans la piscine comme décrit dans la section 3. Transférer chaque poignardé VNC à un puits chacun. </li><li> Placer la capsule 24-puits dans un incubateur à 25 ° C pendant une durée souhaitée en fonction de l&#39;expérience. L&#39;intégrité des cellules n&#39;est pas modifiée pendant au moins 24 heures. </li><li> Après la culture, de transférer les 12 VNC dans 250 pi de PEM formaldéhyde à 4% dans un tube de 1,5 ml en utilisant le pipetman P20 avec la pointe coupée. Ensuite, la fixative est soigneusement pipette, en prenant soin de ne pas endommager les VNC. Une petite quantité de fixatif suffisante pour couvrir les échantillons doivent rester dans chaque tube. Par la suite, ajouter du fixateur frais et agiter doucement pendant 50 min à température ambiante. </li><li> Rincer 2 fois avec du PBS 0,3% Triton X, puis laver 2 fois pendant 10 minutes avec 0,3% de Triton X PBS à température ambiante. </li><li> VNC bloc par incubation avec du sérum de chèvre normal à 10% en 0,3% de Triton X PBS pendant 1 heure à température ambiante. Les échantillons peuvent être conservés à 4 ° C pendant au moins un mois. </li><li> Incuber VNC avec des anticorps primaires pendant plus de 20 heures à 4 ° C. </li><li> Rincer 2 fois avec 0,3% de Triton X PBS, puis laver 3 fois pendant 10 minutes avec 0,3% de Triton X PBS à température ambiante. </li><li> Incuber VNC avec des anticorps secondaires pendant plus de 16 heures à 4 ° C. </li><li> Rincer 2 fois avec 0,3% de Triton X PBS, puis laver 3 fois pendant 10 minutes avec du PBS 0,3% Triton X dans la salle de RT (dans le noir si vous utilisez des anticorps secondaires fluorescents). </li><li> Remplacer PBS avec 50% de glycérol: 50% du PBS pendant au moins uneheures. </li><li> Puis remplacez-le par du glycérol 80%: 20% de PBS pendant au moins une heure. </li><li> Monter un VNC dans une fenêtre ménagée sur 2 couches de cello-bande (environ 0,06 mm) sur une lame de verre microscopie. Ajuster l&#39;orientation, et placer une lamelle (18x18 mm) au-dessus de la fenêtre. Deux VNC peut être monté sur une glissière à l&#39;aide de ce procédé. </li></ol> En utilisant une variété d&#39;anticorps primaires, différentes réponses cellulaires à des blessures peuvent être analysés (par exemple les changements dans le nombre de cellules et la forme des cellules). 7. Analyser données à l&#39;aide ImageJ et une gamme de plug-ins Si la VNC n&#39;a pas poignardé la dégénérescence indépendant, l&#39;échantillon doit être pris en compte dans l&#39;analyse indépendamment de la taille des lésions. Comme coups de couteau se fait manuellement, la taille de la lésion est différente à chaque fois. Ainsi, il est important d&#39;analyser statistiquement l&#39;effet des coups de couteau, chaque fois que possible. <ol><li> Mesure de la taille des plaies. La taille de la plaie est un indicateur de réparation 15.La lésion est visible poignarder comme dépourvu d&#39;expression de GFP. Zone de lésion peut être mesurée à l&#39;aide des données de déchéance disponible gratuitement le logiciel ImageJ, comme suit: <ol><li> Utilisation ImageJ, ouvrez une pile d&#39;images confocales du menu &quot;Fichier&quot;, sélectionnez &quot;Importer&quot; et de là, sélectionnez &quot;séquence d&#39;images&quot;. Cela transforme la collection d&#39;images individuelles dans une pile. </li><li> Suivant changer la &quot;pile&quot; dans un &quot;HyperStack&quot; en allant dans &quot;Image&quot; du menu, sélectionnez &quot;HyperStack&quot;, puis sélectionnez &quot;Stack à HyperStack&quot;. </li><li> Définissez la taille de voxel en utilisant &quot;Propriétés&quot; du menu &quot;Image&quot;. Dans les données acquises à l&#39;aide du microscope confocal Leica SP2, la taille de voxel peut être obtenue à partir de l&#39;analyse de logiciels, et à partir du fichier texte métadonnées enregistrées avec les images. Avec notre milieu tel que décrit dans la section 3, les dimensions en pixels sont xy = 0,366211 um et z = 0,99709 um. </li><li> En examinant toutes les tranches dans un point dans le temps, dessiner le contour maximum de la zone de lésion avec l&#39;outil polygone de sélection dans la barre d&#39;outils. Il s&#39;agit de laRégion d&#39;intérêt (ROI). </li><li> Ajouter le ROI au gestionnaire de ROI en cliquant sur &quot;Analyser&quot; du menu, faites défiler et sélectionnez &quot;Outils&quot;, puis &quot;Gestionnaire de retour sur investissement&quot;, puis &quot;ajouter&quot;. </li><li> Répétez cette opération pour les tous les points de temps. </li><li> Cliquez sur &quot;Mesure&quot; dans le gestionnaire de ROI pour obtenir la taille de la zone de chaque ROI. </li></ol></li><li> Correction du mouvement VNC pendant enregistrements time-lapse. &quot;Stackreg&quot; et &quot;Turboreg&quot; plugins 16 (à partir du site Web de ImageJ <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ): ces plugins permettent de corriger les mouvements de petits échantillons lors de time-lapse. Construire une pile avec une section optique équivalent représentant à travers tous les points de temps et d&#39;appliquer les plugins. Il permet de visualiser la façon dont les changements des lésions dans le temps. Les détails sur ces méthodes et le manuel d&#39;instructions sont disponibles du groupe de recherche qui a développé ces plugins. ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/" target="_blank">http://bigwww.epfl.c</a>h / Thévenaz / stackreg /). </li><li> Comptage automatique des cellules gliales. «Glie DeadEasy&quot; plugin ( <a href="http://www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html" target="_blank">www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html</a> ): il a été développé pour compter le nombre de REPO-positives cellules gliales dans le VNC Drosophila larves et d&#39;examiner l&#39;évolution des cellules gliales Numéro causé des blessures à coups de couteau 17. Le plug-in fonctionne correctement, avec une erreur de 0,1% de faux positifs et de faux négatifs de 4,3% 17. Pour utiliser ce plug-in, première étiquette toutes les cellules gliales (à l&#39;exception de la ligne médiane) dans l&#39;échantillon par immunofluorescence avec des anticorps anti-REPO. Ensuite, installez le plug-in dans ImageJ, ouvrez une pile d&#39;images confocales et exécuter le plug-in. Il compte les cellules gliales automatiquement au bout de 30 secondes. </li><li> Comptage automatique des cellules apoptotiques. &quot;Larves Caspase DeadEasy&quot; plug-in ( <a href="http://www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html" target="_blank">www.bioscienc</a>es-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html) 18: Elle a été développée pour compter le nombre de cellules marquées avec des anticorps anti-fendues-CASPASE3, et une nouvelle version a été adaptée pour les larves VNC. Stabbing blessure provoque une augmentation de la mort cellulaire programmée 11. Pour utiliser ce plug-in, les cellules apoptotiques première étiquette dans l&#39;échantillon par immunofluorescence avec des anticorps anti-fendues-Caspase-3 anticorps. Ensuite, installez le plug-in dans ImageJ, ouvrez une pile d&#39;images confocales et exécuter le plug-in. Il compte les cellules apoptotiques automatiquement au bout de 30 secondes. </li></ol> 8. Réactifs <ol><li> Milieu de culture: Bouclier et moyennes Sang insectes M3, 7,5% de sérum de veau fœtal, 1% et la pénicilline streptomycine 1%. </li><li> 0,01% de poly-L-lysine dans DW stérile. </li><li> Fixateur: formaldéhyde à 4%, ultra pure dans PEM (0,1 M TUBES, 2 mM EGTA 1 mM, MgSO 4) solution. </li><li> Solution de blocage pour immunomarquage: 10% de sérum de chèvre normal dans 0,3% de Triton X PBS. </li><li> Anti-glutamine synthétase2 anticorps: 1:250 dans une solution de blocage. </li><li> Anticorps anti-GFP: 1:1000 dans une solution de blocage. </li><li> Anti-REPO anticorps: 1:250 dans une solution de blocage. </li><li> Anti-ELAV anticorps: 1:250 dans une solution de blocage. </li><li> Anti-clivées Caspase 3 anticorps: 1:1000 dans une solution de blocage. </li><li> Anticorps secondaires: 1:250 dans une solution de blocage. </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous avons établi un protocole pour avoir poignardé une blessure au SNC chez la drosophile larvaires pour enquêter sur les réponses cellulaires aux dommages, la réparation et la régénération. VNC larvaires sont disséqués et poignardé, après quoi ils sont filmés avec time-lapse de microscopie ou fixe pour immunomarquage fluorescence de visualiser les cellules gliales et les neurones, l&#39;apoptose ou la division cellulaire. La progression de la lésion au cours du temps peut être mesuré. Cette méthode est accompagné par un logiciel volontairement développé pour l&#39;analyse quantitative et statistique des changements du nombre de cellules sur les blessures et lors de la réparation. Nous poignardé à 96 heures larves AEL (et ceux-ci ont été soit fixe ou permis de développer plus loin), un stade de développement avant la transition vers la nymphe puis mouche adulte. À 96 h, VNC sont assez grands pour avoir poignardé, ils sont au milieu du stade troisième étape, et ne sont donc pas subir la nymphose encore, et le système nerveux est déjà pleinement fonctionnelle similaire à celle de l&#39;annonceUlt. Il pourrait être possible de poignarder un peu plus tard chez les larves et le calendrier précis doit être choisi en fonction de la question de recherche. Toutefois, en fonction des questions posées, il sera généralement nécessaire à la culture des VNC depuis un certain temps d&#39;observer les réponses cellulaires aux dommages. Quelque temps après le début de HR 120 pupaison AEL, une période où le système nerveux central est rénové et est donc préférable d&#39;éviter. Ainsi, la fenêtre de temps pour avoir poignardé la culture ainsi que dans la larve est plutôt restreinte. En utilisant des larves a encore un grand avantage technique sur l&#39;utilisation adultes: alors que, comme pour l&#39;adulte, le système nerveux est déjà pleinement fonctionnelle, l&#39;analyse de la réponse à la blessure est beaucoup plus facile et plus rapide chez les larves. Lorsque l&#39;on compare la taille et de la morphologie du cerveau et VNC disséqués et mis en culture dans un plat à VNC qui sont disséqués à un moment ultérieur équivalent sans mise en culture dans un plat, il apparaît que le développement est plus lent que dans la culture in vivo. À d&#39;autres égards,développement exerce normalement dans la culture, l&#39;intégrité des tissus est préservée et les cellules sont vivantes qui présente des réponses multiples. L&#39;expansion des plaies, la réparation et la prolifération gliale neuropile avoir lieu dans les 22 heures après avoir poignardé. Cela montre que les réponses cellulaires à des blessures ont lieu dans la culture et il n&#39;y a plus aucun besoin de maintenir les explants pendant plus d&#39;une journée. Si la culture à long terme ont été désiré, le protocole peut nécessiter une optimisation plus poussée comme l&#39;utilisation d&#39;un insert plaque de culture 5. Il est important d&#39;identifier les échantillons de bonne qualité de ceux dégénérescence. Optimisation de ce protocole prend une certaine habileté et, inévitablement, la dégénérescence se produit chez certains spécimens. Le VNC peuvent acquérir un «chou-fleur» l&#39;apparence qui reflète une répartition de l&#39;intégrité tissulaire (figure 5B). La dégénérescence est également reconnu par la vacuolisation de la VNC indépendamment de l&#39;agression, qui peuvent être présents dans intacts, non poignardé spécimens (figure 5C </strong&gt;). Ces échantillons doivent être mis au rebut. La dégénérescence est probablement causé par une dissection grossière, qui peuvent déchirer les nerfs et la couche protectrice de cellules gliales surface. Ainsi, les soins de grande doivent être prises pour disséquer délicatement. Autres facteurs influençant notamment le milieu de culture, qui doit être maintenu propre et avec des antibiotiques, en adhérant strictement aux lavages et les horaires indiqués dans le protocole. Enfin, la longueur du porte-aiguille et l&#39;aiguille, de la taille et de la netteté de l&#39;aiguille sont très importants. Le porte-aiguille peut contaminer le milieu de culture et une aiguille émoussée peut causer une blessure importante qui ne peut pas se réparer et conduire à une dégénérescence. Il est important de systématiquement maintenir l&#39;aiguille pointue. Dans ce protocole, nous avons profité d&#39;une ligne de piégeage des mouches des protéines de visualiser la neuropile en parallèle à la visualisation de processus gliales en utilisant le traditionnel GAL4-UAS système. Ces outils pourraient également être combinés avec d&#39;autres systèmes d&#39;expression binaires tels que le LexA 19 et Q-20 du système, qui sont indépendants de GAL4. Cela permettrait à l&#39;analyse des interactions, par exemple entre les axones et les processus gliales, en réponse à une blessure. En plus de le combiner avec d&#39;autres outils génétiques comme les journalistes de dendrites 21 ou 22 influx de calcium, cette méthode fournit une excellente occasion d&#39;analyser la biologie cellulaire derrière la réponse blessures des cellules gliales, les axones et des dendrites neuronales dans le système nerveux central. Enfin, cette méthode peut être combinée avec la génétique standard, les mutations et sur-expression de gènes, afin de tester la fonction des gènes dans les réponses aux blessures et la régénération. Ce protocole a dirigé avec succès à la découverte d&#39;un réseau de gènes qui sous-tend la réponse régénérative des cellules gliales du système nerveux central des blessures 11. Compte tenu de la conservation évolutive de la fonction des gènes, démêler ces événements cellulaires et les fonctions des gènes dans les mouches à fruits est susceptible de fournir des indications significatives dans la compréhension de maSNC mmalian réponse à une lésion et régénération.

La régénération chez les animaux révèle que les cellules détectent lorsque la croissance organisme est ordonnée et complète, et la façon dont l&#39;intégrité structurelle d&#39;un organisme est atteint et maintenu. La compréhension de ces capacités mystérieuses de cellules est d&#39;un grand intérêt en biologie. Favoriser la régénération est l&#39;un des principaux objectifs à des fins médicales en neurosciences. Chez l&#39;homme, le système endommagé nerveux central (SNC) ne se régénère pas. Des modèles rongeurs de lésions de la moelle épinière sont utilisés pour comprendre comment les cellules répondent à des blessures. Toutefois, les préoccupations éthiques, les coûts élevés et le cycle de vie lente des animaux entravent le progrès. La mouche des fruits Drosophila est un organisme modèle largement utilisé dans la biologie du développement et les neurosciences. Merci à ses puissants outils génétiques et le cycle de vie court, la drosophile a récurrente conduit à la découverte des fonctions des gènes et réseaux de gènes présentant un intérêt pour la compréhension de l&#39;homme et de la maladie. Il ya de nombreuses preuves de l&#39;évolution conconservation de la fonction des gènes des mouches à l&#39;homme. Ces dernières années, plusieurs paradigmes de lésion du système nerveux ont été établis chez la drosophile. Certains se composent d&#39;endommager les nerfs périphériques qui courent le long de l&#39;aile ou axotomie des nerfs périphériques, dont 1 sensoriel et moteur axones 2. Cependant, les systèmes nerveux périphérique et central diffèrent à bien des égards, et il est bien connu que chez de nombreux animaux du système nerveux périphérique peut se régénérer tandis que le SNC ne peut pas. Ainsi, pour comprendre la régénération du SNC, atteinte directe à la CNS est plus approprié. Blessures poignardant avec une aiguille a été appliquée avec succès dans le cerveau adulte chez la drosophile pour étudier la réponse à une lésion 3,4. En utilisant une autre approche, Ayaz et al. Axones sectionnés SNC chez les cerveaux adultes cultivés avec un microdissector Piezo électrique et analysé leur régénération pendant 4 jours 5. L&#39;avantage de ces u jeu plus tard expérimentaleps est qu&#39;ils se concentrent sur le cerveau, ce qui est sans aucun doute d&#39;un grand intérêt. L&#39;inconvénient est que le cerveau est beaucoup plus complexe que le VNC, qui ne traite que du moteur et contrôle sensoriel. Travail sur le cerveau adulte est aussi beaucoup plus de temps. La larve est prête pour des expériences en 4 jours, alors qu&#39;il faut environ 10 jours pour l&#39;éclosion des adultes, puis supplémentaire de 5 jours pour leur maturation. Le cerveau adulte est également plus difficile à gérer, car il est encapsulé dans une cuticule épaisse, ce qui est difficile à enlever. Le VNC présente l&#39;avantage supplémentaire d&#39;être fonctionnellement équivalente à la moelle épinière vertébré. La larve Drosophila est largement utilisée comme organisme modèle pour les neurosciences 6-9. Bien qu&#39;à proprement parler la larve est dans une phase de développement, il peut également être considéré comme un animal entièrement fonctionnel. La larve a la locomotion, de multiples sens, y compris l&#39;olfaction, du goût et de la nociception, et l&#39;apprentissage et la mémoire. Ainsi, les larves VNC wque choisi comme le modèle idéal pour une lésion du SNC. VNC larves et des pupes peuvent être disséqués et mis en culture dans un plat, en conservant l&#39;intégrité cellulaire jusqu&#39;à 24 h 10. Cela suggère que le préjudice pourrait être appliquée à la VNC, qui pourrait ensuite être enregistrées dans time-lapse pour cours de cette période de temps, ou cultivées et fixées à n&#39;importe quel point dans le temps désiré à l&#39;intérieur de cette période. Ici, nous présentons un paradigme expérimental de lésion du SNC en utilisant la drosophile larves VNC. La VNC est d&#39;abord disséqué de la larve, et les blessures coup de poignard est appliqué manuellement à l&#39;aide d&#39;une aiguille de tungstène. La VNC est ensuite placée sur une lamelle de verre à fond, et filmé avec time-lapse microscopie confocale à balayage laser. Alternativement, les VNC peuvent être cultivés pendant une période de temps désirée, et les effets cellulaires de blessures peuvent être analysés dans les échantillons fixes à l&#39;aide immunomarquage et microscopie confocale. La zone de la plaie peut être mesurée, et une analyse quantitative des cellules numbre (prolifération cellulaire et la mort cellulaire) peut être réalisée avec un logiciel développé à dessein. Échantillons de grande taille peuvent être facilement manipulés, ce qui entraîne des résultats statistiquement validés. Ces méthodes ont été combinées avec succès la génétique de la drosophile puissants de découvrir un réseau de gènes qui sous-tend la réponse des cellules gliales de régénération à une lésion du SNC 11.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> Coloration bloc </td><td> Microscope Brunel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Forceps No. 5 </td><td> par exemple Outils Fine Science </td><td> par exemple 11251-20 </td><td></td></tr><tr><td> Aiguille de tungstène: diamètre de la tige, 0,5 mm; diamètre de buse, 1 um, longueur, 2 cm </td><td> Roboz instruments chirurgicaux </td><td> RS-6065 </td><td></td></tr><tr><td> Porte-aiguille </td><td> Roboz instruments chirurgicaux </td><td> RS-6060 </td><td></td></tr><tr><td> Arkansas pierres: Kit de réparation pour Dumont Forceps </td><td> Outils Fine Science </td><td> 29000-00 </td><td></td></tr><tr><td> 35 mm boîte de Petri de 27 mm de verre de base </td><td> Iwaki </td><td> 3930-035 </td><td></td></tr><tr><td> Leica SP2 AOBS microscope confocal inversé avec chambre à environnement </td><td> Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactif </td></tr><tr><td> Bouclier et Sang insectes M3 support (ecdysone gratuit) </td><td> Sigma </td><td> S3652-500 ml </td><td></td></tr><tr><td> La pénicilline et de la streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon phosphate salin (PBS) </td><td> Voir 12 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Sigma </td><td> F7524 </td><td></td></tr><tr><td> La poly-L-lysine </td><td> Sigma </td><td> P1399-25mg </td><td></td></tr><tr><td> Le formaldéhyde, 10%, sans méthanol, Ultra Pur </td><td> Polysciences </td><td> 04018-1 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Anticorps de souris anti-synthétase glutamine </td><td> Millipore </td><td> MAB302 </td><td></td></tr><tr><td> Lapin anti-GFP anticorps </td><td> Technologies du vivant </td><td> A11122 </td><td></td></tr><tr><td> Souris anti-anticorps REPO </td><td> Developmental Studies Hybridoma banque </td><td> 8D12 </td><td></td></tr><tr><td> Rat anticorps anti-ELAV </td><td> Developmental Studies Hybridoma banque </td><td> 7E8A10 </td><td></td></tr><tr><td> Lapin anti-caspase 3 anticorps actifs </td><td> Abcam </td><td> ab13847 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum normal de chèvre </td><td> Vector Laboratories </td><td> S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-lapin Alexa Fluor 488 </td><td> Technologies du vivant </td><td> A11034 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-souris Alexa Fluor 647 </td><td&gt; Vie technologies </td><td> A21236 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-rat Alexa Fluor 647 </td><td> Technologies du vivant </td><td> A21247 </td><td></td></tr></tbody></table>

an injury paradigm to investigate central nervous system repair in drosophila

Une méthode expérimentale a été développée pour étudier les réponses cellulaires du système nerveux central (SNC) des blessures en utilisant la drosophile la mouche des fruits. Comprendre réparation et la régénération chez les animaux est une question clé dans la biologie. Le CNS endommagées de l&#39;homme ne se régénère pas, et de comprendre comment favoriser la régénération est l&#39;un des principaux objectifs de la médecine neurosciences. La boîte à outils puissante génétique de la drosophile peut être utilisé pour résoudre le problème de la régénération du SNC. Une lésion de la moelle CNS nerveuse ventrale (VNC, équivalent à la moelle épinière vertébré) est appliqué manuellement à l&#39;aide d&#39;une aiguille de tungstène. Le VNC peut ensuite être filmé en time-lapse en utilisant la microscopie confocale à balayage laser pour un maximum de 24 heures pour suivre l&#39;évolution de la lésion au fil du temps. Alternativement, il peut être mis en culture, puis fixées et colorées par immunofluorescence pour visualiser des neurones et des cellules gliales en microscopie confocale. En utilisant des marqueurs appropriés, changes de la morphologie cellulaire et état de la cellule à la suite de blessures peuvent être visualisées. Avec ImageJ et volontairement développé des plug-ins, des analyses quantitatives et statistiques peuvent être effectuées pour mesurer les changements dans la taille des plaies au fil du temps et les effets de la lésion dans la prolifération cellulaire et la mort cellulaire. Ces méthodes permettent l&#39;analyse des échantillons de grande taille. Ils peuvent être combinés avec les puissants génétique de la drosophile pour étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la régénération du SNC et de réparation.

Ici, nous montrons comment effectuer une blessure lancinante à la VNC Drosophile larvaire et analyser les réponses cellulaires à l&#39;aide d&#39;une blessure time-lapse et immunomarquage microscopie confocale de fluorescence. Pour des données à intervalles de temps, la lésion est visualisée sous la forme d&#39;une zone de GFP-négative dans le neuropile d&#39;échantillons portant le marqueur G9 axonale (figure 2). Peu de temps après avoir poignardé, GFP-négatifs petites zones, qui ressemblent à des trous ou des vacuoles, commencent à apparaître (figure 2A). Une telle GFP-négatifs zones généralement agrandir jusqu&#39;à environ 6 à 8 heures après avoir poignardé (figure 2A). Par la suite, les zones GFP-négatifs rétrécir et peut même disparaître (figure 2B). En 22 heures après avoir poignardé, la superficie occupée par la blessure est généralement inférieure à la superficie maximale est de 6 à 8 heures après avoir poignardé (figures 2a, b). De même, la zone DsRed négatif dans les processus gliales augmente initialement trop, mais Shrinks de 22 h après avoir poignardé. Fait intéressant, souvent DsRed-positives processus gliaux remplir les trous GFP-négatives dans le neuropile avant sa disparition (figure 2C). Utilisation immunomarquage des spécimens fixes, de beaux processus gliales et leur réponse aux blessures peuvent être visualisées avec une meilleure résolution qu&#39;avec time-lapse images. Cela peut être fait, par exemple, en utilisant le pilote repoGAL4 gliales pour induire l&#39;expression d&#39;un journaliste membrane captif (par exemple SAMU-mCD8GFP) chez les mouches de visualiser toutes les cellules gliales (à l&#39;exception de la glie ligne médiane). Cela peut également être combiné avec d&#39;autres marqueurs gliaux, tels que les anti-GS2, qui marque neuropile associées à des cellules gliales (figures 3A, B). Ici, nous montrons que, bien que la corde nerveuse ventrale est poignardé à partir de la face dorsale, lancinante blessure résulte d&#39;une dent ventrale (figure 3A, pointes de flèches). Stabbing semble affecter plus gravement le neuropile et neuropile associée ème cellules glialesune surface du cortex et des cellules gliales (figure 3B). Processus gliaux semblent désorganisés dans le neuropile, alors ils maintiennent toujours leur maillage comme organisation dans le cortex. Lésion entraîne GS2-positif débris cellulaires, qui est distincte de cellules normales que des fragments de débris sont beaucoup plus faibles, et non reliée à un corps de cellule. Cela révèle des dommages à neuropile associés cellules gliales (figure 3B). Dégénérescence neuropile associés cellules gliales ont également été observées par microscopie électronique 15. Anti-fendues-Caspase 3 + coloration apoptose est observée dans neuropile associés aux cellules gliales 15, montrant qu&#39;ils entrent en apoptose lors de coups de couteau blessure. Neuropile cellules gliales associées ont également été montré à phagocyter les débris neuronale 15, et GS2 + signal pourrait aussi révéler l&#39;engloutissement de neurones apoptotiques par des processus gliales. Fendues Caspase-apoptotiques des cellules + sont également observées dans le cortex, au moins certaines d&#39;entre elles correspondent à des neurones Elav + ( <strong&gt; Figure 3C). En utilisant des échantillons fixes et immunomarquage permet également des analyses quantitatives des réponses cellulaires aux dommages, tels que les effets de la prolifération et l&#39;apoptose. Pour cela, nous avons délibérément mis au point deux ImageJ plug-ins, Larve Caspase DeadEasy et Glia DeadEasy, à compter automatiquement le nombre de cellules gliales et les cellules apoptotiques, respectivement. Ils ont été validés pour travailler sur les VNC larvaires et sont très précis. Grâce à eux, il est possible d&#39;observer une augmentation du nombre de REPO-positives cellules gliales causés par une blessure lancinante, de 22 h (figure 4A) 15. Il ya aussi une augmentation du nombre d&#39;anti-fendues-Caspase-3 cellules apoptotiques de 6 heures après l&#39;avoir poignardé (figure 4B) 15. Une telle augmentation de la prolifération des cellules gliales et de l&#39;apoptose en réponse aux lésions dans le SNC chez la drosophile n&#39;est pas sans rappeler la réponse des blessures dans le SNC des vertébrés. Un aspect crucial de ce proprotocole est la qualité de la dissection VNC. Il est difficile de dire au moment de la dissection si les VNC ont été endommagés ou non dans le processus. Il est important de prendre un soin particulier à effectuer des dissections douces. Cependant, les échantillons de mauvaise qualité seront inévitablement produit, et il est essentiel que ceux-ci sont identifiés à un stade ultérieur et mis au rebut. Dans nos mains, la dégénérescence VNC ne semble pas lié à une blessure, mais plutôt causé par la dissection grossière. Nous n&#39;avons pas observé une taille critique dans la plaie blessure, et nous analysons tous les échantillons blessés qui ne sont pas dégradées. Lorsque VNC maintenir leur intégrité, la surface VNC a tendance à regarder lisse et brillant, et pas de trous dans le neuropile sont observées (figure 5A). La dégradation de VNC peut être reconnu par 24 heures post-dissection de la surface rugueuse des zones VNC ventrales et latérales (figure 5B). La dégradation de la neuropile rien à voir avec une blessure lancinante peut également se produire, et il est reconnu comme neuropile holes dans le signal de fond de spécimens immunocolorées. Les échantillons avec ces signes de dégénérescence doit être éliminée (figure 5C). Dans nos mains, le taux de réussite pour la dissection et le contrôle des blessures intacte et poignardé (yw) sont à la fois les mouches autour de 70%. Ce taux varie en fonction de l&#39;habileté de la personne qui effectue les expériences, et avec le génotype. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma des larves de mise en scène et lancinante blessure. (A) Au jour 0, les mouches sont autorisés à pondre des oeufs dans une boîte de Pétri jus de raisin pendant 3 heures. Au jour 1, l&#39;éclosion des larves de premier stade (L1) sont recueillis et placés dans des flacons contenant de la nourriture de levure standard, où ils sont conservés pendant 3 jours. Au jour 4, les larves sont collectées à partir flacon alimentaire, et utilisé pour les expériences de poignard. (B) Vue latérale du système nerveux central des larves.La région abdominale du cordon nerveux ventral est poignardé avec une aiguille de la face dorsale. Est antérieure à la gauche et vers la droite postérieure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig2.jpg" /> Figure 2. Time-lapse progression de la lésion VNC. Microscopie confocale sur les VNC en direct avec des axones GFP-étiquetés et marqués DsRed cellules gliales. Génotype:. UASDsRed / +; G9 / +; repoGAL4 / + (A) La lésion est reconnue par l&#39;absence de fluorescence sur le neuropile axonale. Après avoir poignardé, GFP-négatives des trous apparaissent, par la suite augmenter en taille et en nombre. Projections des 5 sections optiques de chaque point de temps après avoir poignardé blessures. (B) Les axones se rétrécit lésion neuropile de 9 h après avoir poignardé. Ces images sont simples sections optiques de différents points de temps après avoir poignardé une blessure. Pour identifier les postes équivalents dans chaque échantillon, le nombre même tranche d&#39;eapoint dans le temps ch dans la pile de time-lapse de données a été choisi. En comparant les modèles visualisés avec G9 et repoGAL4&gt; UASmCD8GFP dans la zone non affectée par le coup de couteau, les tranches ont été vérifiés comme étant des postes équivalents dans l&#39;axe Z. Les lignes pointillées dans (A, B) indiquer le bord de la plaie. (C) à fort grossissement des blessures sur le neuropile. GFP-négatifs orifices sont bouchés avec DsRed-positives processus gliaux, et ont ensuite disparu (pointes de flèches). Vue horizontale. Jusqu&#39;à antérieure. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig3.jpg" /> Figure 3. Caractérisation cellulaire de la lésion VNC. VNC portant un rapporteur GFP membrane captif pour toutes les cellules gliales (cellules gliales, sauf la ligne médiane) colorées avec des anticorps anti-GFP et anti-GS2, un marqueur neuropile associée à des cellules gliales. Génotype:. + / +; UASmCD8GFP / +; repoGAL4 / + (A) VNC ont été poignardés à partir de la dorcôté sal, mais cela provoque une brèche ventralement (pointes de flèches). Vue sagittale de simples sections optiques, gauche dorsale et antérieure. (A, B) Stabbing blessure affecte plus sévèrement neuropile associée à des cellules gliales que les cellules gliales du cortex et de surface. Blessure entraîne GS2-positif débris cellulaires (pointes de flèches en B). (B) Vue horizontale de simples sections optiques, jusqu&#39;à antérieure. Des pointes de flèche indiquent GS2 + débris cellulaires. (C) co-localisation du marqueur anti-apoptotique fendues-caspase-3 et le marqueur neuronal anti-Elav montrant que sur un dommage certaines des cellules meurent dans le cortex sont des neurones. np, neuropile; cx, le cortex. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig4.jpg" /> Figure 4. Comptage automatique des cellules gliales et les cellules apoptotiques en utilisant DeadEasy. (A) Exemple d&#39;utilisation de &#39;cellules gliales DeadEasy larvaire »à compter REPO positifles cellules gliales. Gauche: les moitiés VNC ventrales colorées avec des anticorps anti-REPO; moyennes: sortie de la glie larves DeadEasy montrant des cellules identifiées par le plug-in, à droite: fusionner. Les nombres sur la droite sont le nombre de cellules positives REPO en compte automatiquement dans une pile de sections optiques confocaux à environ 30 secondes. L&#39;augmentation du nombre de cellules gliales dans les VNC poignardé. (B) Exemple d&#39;utilisation de &quot;larve Caspase DeadEasy». Projections de 5 sections optiques confocaux colorées avec des anticorps anti-fendues-Caspase 3 anticorps; moyennes:: Gauche sortie montrant des cellules identifiées par le plug-in, à droite: fusionner. Les nombres sur la droite sont le nombre de cellules positives CASPASE en compte automatiquement dans une pile de sections optiques confocaux à environ 30 secondes. Le nombre de cellules apoptotiques augmente dans la poignardé VNC. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig5.jpg" /> Figure 5. Des exemples de degeneration. (A) Une saine VNC. Il n&#39;y a pas de signes de dégénérescence. (B) Le côté du thorax se dégrade (pointes de flèches) dans un échantillon poignardé. L&#39;astérisque indique site de la lésion. (C) Des trous dans la neuropile thoracique (tête de flèche blanche) et le cortex (orange tête de flèche) dans un non-poignardée VNC. Les échantillons présentant une vacuolisation neuropile vaste et endommagé doit être jeté. Voici les VNC ont été colorées avec le marqueur associé neuropile gliales anti-ébène. Vue horizontale, jusqu&#39;à antérieure.

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An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

Un paradigme blessures en utilisant le cordon Drosophile larvaire nerveuse ventrale pour enquêter régénération du système nerveux central et de la réparation est décrite. Stabbing suivi par microscopie confocale à balayage laser dans des échantillons de time-lapse et fixe, combinée à une analyse quantitative d&#39;un logiciel développé à dessein et de la génétique, sont utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires de la régénération du SNC et de réparation.

Un paradigme d&#39;enquêter sur les blessures du système nerveux central de réparation de<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

13.2K vues.  University of Birmingham. Un paradigme blessures en utilisant le cordon Drosophile larvaire nerveuse ventrale pour enquêter régénération du système nerveux central et de la réparation est décrite. Stabbing suivi par microscopie confocale à balayage laser dans des échantillons de time-lapse et fixe, combinée à une analyse quantitative d'un logiciel développé à dessein et de la génétique, sont utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires de la régénération du SNC et ...

Vidéo: An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

La visualisation du système nerveux embryonnaire, en totalité montage Drosophile Embryons

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Recherche

Neurosciences

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagerie multimodale d&#39;implantation de cellules souches dans le système nerveux central de souris

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

La production de vecteurs lentiviraux pour les cellules de transduction du Système Nerveux Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Étiquetage des cellules isolées dans le système nerveux central des<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Livraison intraventriculaire directe des médicaments pour le système nerveux central rongeurs

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

En Interrogation in vivo de système nerveux central Translatome par polyribosome fractionnement

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing optique du système nerveux central de souris utilisant CLARITY passive

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

Réseaux de neurones conçus par micro-tissus tridimensionnels inspirés anatomiquement pour la reconstruction, la modulation et la modélisation du système nerveux

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Quantifying Acute Changes in Renal Sympathetic Nerve Activity in Response to Central Nervous System Manipulations in Anesthetized Rats

Renal sympathetic nerve activity (RSNA) and mean arterial pressure are important parameters in cardiovascular and autonomic research; however, there are limited resources directing scientists in the techniques for measuring and analyzing these variables. This protocol describes the methods for measuring RSNA and mean arterial pressure in anesthetized rats. The protocol also includes the approaches for accessing the brain during RSNA recordings for central nervous system (CNS) manipulations. The RSNA recording technique is compatible with pharmacologic, optogenetic, or electrical stimulation of the CNS. The approach is useful when an investigator will measure short-term (min to h) autonomic responses in non-survival experiments to correlate anatomically with CNS nuclei. The approach is not intended to be used to obtain chronic (survival) recordings of RSNA in rats. Discharges in RSNA, averaged rectified RSNA, and mean arterial pressure can be quantified and analyzed further using parametric statistical tests. Methods for obtaining venous access, recording mean arterial pressure telemetrically, and brain fixation for future histological analysis are also described in the article.

Methods for measuring sympathetic and cardiovascular responses to central nervous system (CNS) manipulations are important for advancing neuroscience. This protocol was developed to assist scientists with measuring and quantifying acute changes in renal sympathetic nerve activity (RSNA) in anesthetized rats (non-survival).

Quantifier les changements aigus dans l’activité nerveuse sympathique rénale en réponse à des Manipulations du système nerveux Central chez le rat anesthésié

Renal sympathetic nerve activity (RSNA) and mean arterial pressure are important parameters in cardiovascular and autonomic research; however, there are ...